检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的正向基因芯片的制备

通过分析比较禽流感病毒H5、H7和H9亚型不同毒株的基因组序列,设计出H5、H7和H9亚型特异性引物与探针,将扩增产物点制在芯片上,分别用H5、H7和H9亚型特异性探针与芯片杂交,研制出用于禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测的正向杂交基因芯片,同时对正向基因芯片进行特异性、敏感性试验,并用该方法对待检样品进行了检测。结果表明,禽流感病毒正向基因芯片与新城疫病毒、传支病毒等6种禽类常见病毒无反应,其敏感性高于常规PCR方法。     

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性.表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒.但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性.推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解.     

小议我国现阶段禽流感疫苗的特点与管理

禽流感是禽流行性感冒的简称,是A型禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病.人禽流感是由A型禽流感病毒某些亚型毒株引起的人类急性呼吸道传染病.近几年来,世界各地相继出现了感染禽流感病毒发病病例,蔓延迅速,病情较重,死亡率较高.使用疫苗接种可以有效的降低感染、减少病毒的排放,有效的遏制了疲情的传播,从而有助于根除感染,是防止禽流感的一种有效的方法.本文在分析禽流感病毒理论的基础上,对高致病性禽流感疫苗的种类与管理进行了分析,以供参考.     

利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒

根据百合无症病毒(LSV)的核苷酸序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增得到了一条与目的片段大小一致的条带;进一步克隆测序表明,该序列与已知的LSV序列有96%的同源性.用随机引物法合成地高辛标记的cDNA探针,建立了核酸斑点杂交检测体系.本研究分别建立了用于LSV的特异性的高灵敏度RT-PCR检测体系(其检测灵敏度为1.4ng/叶片)和适合大通量检测的Dig-cDNA(地高辛标记)核酸斑点杂交检测体系(其检测灵敏度为20μg/叶片).     

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

GICA检测高致病性禽流感抗体方法的建立

[目的] 建立可快速、简便地检测微量禽流感的抗体的方法.[方法] 利用灭活的高致病性禽流感病毒H5N1建立禽流感病毒浓缩纯化样品体系,获得大量纯度较高的禽流感病毒(1512).将2.80mg/mL纯化病毒与一定大小的胶体金颗粒偶联,吸附在玻璃纤维上,制作的高致病性禽流感病毒抗体胶体金检测试纸条,用于高致病性禽流感定量(合格)检测.[结果] 显色反应良好,条带稳定,检测获得成功.[结论] 其反应特异性、敏感性、重复性良好,具备微量、快速、简便的特点,适合于进出境现场检疫和疫情普查.     

五种马病毒基因芯片检测方法的建立

[目的]既保护我国畜牧业的安全,又在检验检疫口岸实现马匹的快速通关,探索建立马病毒基因芯片检测方法。[方法]采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒核酸序列、通过分子克隆技术获得西尼罗热、马冠状病毒、马鼻肺炎病毒和马动脉炎病毒的特异基因片段,设计合成五种马病病毒高度保守的特异性核酸序列作为检测探针点制于芯片上,再用多重不对称PCR以拼接、克隆的核酸序列为模板扩增目的片段,与芯片上探针特异结合。[结果]建立了五种病毒的基因芯片快速检测方法,实现了五种马病同时检测。[结论]本研究建立的芯片快速高通量基因芯片检测方法可应用于大规模出入境马属动物的快速筛查。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因克隆及分子进化分析

用RT-PCR方法,以1株H2N2亚型禽流感病毒分离株RNA为模板,扩增了HA全基因cDNA.将HAcDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行了测序.测序结果表明所克隆的1685bp核苷酸片段包含了全部HA基因阅读框架和上下游引物,编码区为1683个核苷酸,编码560个氨基酸.将其序列与其他8株H9N2亚型禽流感病毒HA基因及推导的氨基酸序列进行比较,其核苷酸同源性在85.3%～98.6%之间,氨基酸同源性在88.8%～98.9%之间,HA基因裂解位点氨基酸序列没有连续碱性氨基酸插入.本研究结果为国内基因工程疫苗等研究奠定了基础,同时通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系.     

五种血清型柯萨奇病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

在柯萨奇病毒基因组VP1区设计引物和探针,分别建立了特异性检测5种血清型（A9、A16、B2、B3和B5型）柯萨奇病毒（Coxsackievirus）基于MGB探针的实时荧光RT-PCR方法。通过构建的分别适于5种血清型病毒检测的质粒标准分子对建立的检测体系进行了灵敏度分析,确定5种血清型柯萨奇病毒检测体系的检测下限均为2拷贝质粒标准分子DNA。     

中强毒力新城疫病毒（NDV）荧光RT—PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针,从中筛选出最佳引物、探针配对,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT-PCR.     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

用RT-PCR快速检测Taura综合症病毒

用RT-PCR快速检测南美白对虾中的Taura综合症病毒.引物TSVF和TSVR用于扩增病毒核酸中的231bp的片段.该方法能可靠地检测到患病的南美白对虾体内的Taura综合症病毒.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.     

常用禽流感检测技术及其在检验检疫领域中的应用

通过对目前常用的禽流感检测技术如琼脂凝胶扩散试验(AGP)、血细胞凝集抑制试验(HI)、鸡胚病毒分离试验、FLISA方法、免疫荧光技术、RT-PCR技术和荧光RTPCR技术等试验方法和技术收集和分析,以及这些技术在检验检疫领域的应用,探讨了这些方法的优缺点和在检验检疫领域应用的实用性.最后重点介绍了在检验检疫领域最具有应用优势的荧光RT-PCR方法检测禽流感的技术.     

基因芯片技术快速检测SARS病毒

以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测,结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好,稳定快速,在检验检疫中应用是可行的.     

基因芯片技术快速检测SARS病毒

本研究以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测,结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好,稳定快速,在检验检疫中应用是可行的.     

7种甲型H1N1流感病毒核酸检测方法的比较和验证

[目的]比较和验证7种甲型H1N1流感病毒核酸检测方法,筛选出可用于实验室日常检测的方法,并证实实验室具有正确操作这些方法的能力。[方法]应用7种方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,包括5种SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法和2种Taqman探针荧光RT-PCR法的商业试剂盒,用于方法比较和验证的参考样品包括猪流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、能力验证样品等不同来源的核酸。[结果]2种预期用于猪流感H1N1病毒核酸检测的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法均能达到预期目的;3种预期用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸检测的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法均无法区分2009年新甲型H1N1流感病毒核酸和猪流感H1N1病毒核酸;2种Taqman探针荧光RT-PCR试剂盒均能正确检出2009年新甲型H1N1流感病毒核酸,但只有1种可检出能力验证阳性样品。[结论]5种SYBRGreen Ⅰ荧光RT-PCR法中有2种能用于猪流感H1N1病毒核酸的检测,另外3种不能用于新甲型H1N1流感病毒核酸的检测;2种Taqman探针荧光RT-PCR法的商业试剂盒能用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸的检测。     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Yvein necrosis strain,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本研究根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP）基因序列保守区域,设计合成了两对巢式PCR引物和一条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Real-time PCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Real time PCR等方法高。该方法检测灵敏度可达3 fg/μL植物总RNA。利用四对引物和一条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,检测的准确性比其它方法高。