实时荧光定量PCR在食品微生物检测中的应用和质量控制

通过概述实时荧光定量PCR技术的原理、特点,以及其在食品微生物检测、转基因食品等领域的应用和质量控制情况,旨在为食品安全监测提供依据。     

实时荧光定量PCR鉴别食品中猪源性成分的研究进展

本文针对目前鉴别食品中猪源性成分的方法,即实时荧光定量PCR技术进行综述,并展望其应用前景。     

数字PCR技术及其在微生物检测中的应用

数字PCR是继实时定量PCR之后新兴的一种绝对定量分析技术。近年来,世界各国都非常重视数字PCR检测技术的研究和应用。因此,有必要建立快速简单、高灵敏度、高精确度的微生物检测方法。本文介绍了数字PCR技术的基本原理,概述了其在微生物检测领域的应用进展。     

进境谷物中转基因油菜籽RT73的定性定量检测

[目的]转基因作物可能会以杂质的形式混入到谷物中,所以要加强对谷物中杂质的转基因成分检测.[方法]利用常规定性PCR方法和实时荧光PCR方法对来源于进境谷物中的32份转基因油菜籽样品进行了转基因油菜RT73的检测.[结果]通过常规定性PCR检测,检出28份转基因油菜籽含RT73;使用ABI 7700定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测,检出31份转基因油菜含RT73,其含量分别为0.03%～97.7%.[结论]其进出口谷物杂质中混有转基因成分,口岸检验检疫机构要加强其检测.     

数字PCR及荧光定量PCR测定豆乳饮料转基因成分分析

研究将转基因启动子CaMV35s、终止子NOS基因作为靶标,内标选择大豆内源基因Lectin,分别采用微滴式数字PCR及实时荧光PCR对标准品转基因大豆进行检测,实测20批次豆乳饮料转基因成份。结果显示,与实时荧光PCR相比,微滴式数字PCR对转基因筛查浓度检测低限、含量低限均较低,分别为0.04 ng/反应、0.05%,与欧盟转基因标识阈值要求符合。20批次样品中有16批次经过不同平台检测结果为阴性,1批次为阳性,3批次经过数字PCR检测获得准确结果,表明该检测技术能对实时荧光PCR起到辅助检测作用。     

结核菌快速检测方法用于口岸检疫的研究

[目的]评价两种结核菌快速检测方法在口岸卫生检疫中的应用价值。[方法]以＂中华人民共和国行业标准-肺结核诊断标准WS288-2008＂选取结核病人100例,有呼吸道症状的疑似病人50例,以罗氏L-J固体培养结果为标准,考核荧光实时定量PCR（RT-PCR）、分枝杆菌直接检测（MDT）在结核病诊断的敏感性、特异性。[结果]100例结核病人标本培养后均为阳性,50例可疑者标本培养后均为阴性;100例培养阳性的标本,荧光实时定量PCR检测出98例阳性,MDT检测出100例阳性;50例培养阴性标本,荧光实时定量PCR检测出1例阳性,MDT未检测阳性。RT-PCR的敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值为98.04%、98.04%、99.01%、96.15%;MTD检测敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值均为100%。[结论]与传统培养方法相比较,两种方法有着很高的敏感性和特异性,但检测时间大大缩短,适合应用于口岸卫生检疫中。     

荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS

根据转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)基因序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针,建立一种应用荧光双链探针的实时PCR定量检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S和NOS基因成分,其余6份样品结果为阴性.结果表明本文建立的荧光PCR方法能有效检测出35S和NOS两种转基因成分,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

GI型札幌病毒的检测方法研究

札幌病毒（Sapovims,SV）属于杯状病毒科,是急性胃肠炎的主要病原体之一。本文使用多对引物和探针对SV进行了普通RT—PCT和实时荧光RT—PCR检测,筛选出了比较理想的引物和探针,进而建立了贝类产品中SV的RNA提取方法、普通RT—PCR和实时荧光RT—PCR方法。     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

目的:弗尼斯弧菌(Vibrio fumissii)是引起世界范围内胃肠功能紊乱的致病菌之一,一般通过摄人生的或者未煮熟的水产品进行传播。本研究旨在建立高效、可靠的PCR检测方法应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。方法和结果:根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计普通PCR引物及实时PCR引物、探针,建立普通PCR和实时荧光PCR方法,分别对两种方法的特异性和灵敏度进行比较分析,同时应用于384份食品样品检测。结果表明,建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为:2.4×10^3 CFU/ml和24 CFU/ml,并于5 h内完成整个检测过程,同时对384份食品进行检测,共检出6株阳性菌株。结论:本研究建立的PCR检测技术灵敏度高、特异性好,可应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。     

矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力验证结果评价

目的:通过对矿泉水中铜绿假单胞菌的检测能力验证计划[ACAS-PT551(2018)],确保南平市食品药品检验检测中心微生物实验室具备检验该菌的能力,出具公平公正、合法有效的检验检测报告。方法:依据能力验证参试指导书,利用实时荧光定量PCR法进行快速筛查,同时按国家标准GB 8538-2016法对两个盲样进行检测。结果:两种方法皆显示这两个盲样中存在铜绿假单胞菌,样品18-U262报出值为4600CFU/250mL,样品18-N396报出值为2 200 CFU/250 mL。结论:本次试验Z值分别为0.3和0.5,|Z|均小于2,评价结果满意,说明本实验室具备检验该菌的能力;同时两种方法结果一致,说明实时荧光定量PCR法可辅助国标法进行快速筛查,提高检测效率。     

食品中罂粟壳残留分析的研究进展

本文阐述了罂粟壳残留分析的研究背景和现状,并对食品中罂粟壳残留现场快速检测方法、实验室确证分析方法以及新型分析技术(实时荧光PCR技术和LAMP技术)等进行综述,为食品中罂粟壳非法添加的监管提供参考。     

两种锥虫双重实时荧光PCR检测方法的建立

通过比较美洲锥虫和非洲锥虫基因组的保守性与特异性,设计2套锥虫特异性引物和探针用于核酸检测,美洲锥虫和非洲锥虫分别使用HEX和FAM荧光基团标记探针,建立美洲锥虫和非洲锥虫的双重实时荧光PCR检测方法,并对建立的方法进行灵敏度、特异性和重复性分析.结果显示,新建立的双重实时荧光PCR检测方法只对2种锥虫阳性对照模板有特...     

SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病

[目的]利用SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病.[方法]根据传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)Y10404的序列合成部分基因片段,将其插入到T载体中,构建阳性质控品;并设计合成一对特异性引物.利用阳性质控品建立SYBR-Green Ⅰ实时荧光PCR方法,对反应体系进行优化,进行特异性和敏感性分析,并制作标准曲线.[结果]最佳引物终浓度为0.51μmol/L.所建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法能够特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5× 10-8 μg/μL,其灵敏度比传统PCR高1000倍;能够从阳性样品中检出ISAV,Tm值为82.5℃.建立了标准曲线,其r2＞0.99.     

实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒

对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）感染引起,所有养殖对虾对该病高度易感,蟹类、小龙虾、淡水虾以及各种龙虾也易感,但发病率和死亡率有很大差别。多种虾类常表现为持续感染或终身隐性感染。隐性感染虾体内的病毒含量极低,需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法。本文应用TaqMan探针技术设计了探针和引物,建立了检测WSSV的实时荧光定量PCR方法。对影响PCR反应的主要因素Mg^2＋浓度和退火温度等进行了优化,证明当Mg2＋浓度为3.5～4.0 mmol,退火温度为59～60℃时可获得最佳的扩增和检测效果。     

核酸扩增技术及其在动物检疫中的应用、挑战与对策

核酸扩增技术是一种在生物技术领域广泛使用的技术,可通过特定的方法将DNA或RNA片段扩增至百万倍甚至更高倍数,从而检测和识别这些片段。核酸扩增技术包括多种方法,如实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、数字PCR技术（digital PCR,dPCR）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）等。在动物检疫方面,通过对动物体内特定病原体的核酸进行扩增,可以快速、准确地检测出该病原体,并采取相应的防控措施;通过对动物源性食品中的病原微生物进行核酸扩增,可以检测出食品中的细菌、病毒等有害物质,保证食品的安全性。随着技术的发展,核酸扩增技术将更加自动化、高通量和快速,灵敏度和特异性将进一步提高。随着微流控技术和纳米技术的发展,核酸扩增技术将变得更加便携,与人工智能、大数据等技术结合,实现智能化和信息化检测,多学科交叉将成为核酸扩增技术发展的重要趋势,有助于推动该技术的创新和应用。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR鉴定简单异尖线虫方法的建立

根据GenBank发表的简单异尖线虫保守的ITS-2基因序列设计一对引物,用以扩增简单异尖线虫114 bp基因片段。用简单异尖线虫的重组质粒（AS-ITS-pGM）为模板建立SYBR Green I荧光定量PCR检测简单异尖线虫的方法,并用该方法对经PCR-RFLP鉴定为简单异尖线虫的样品进行鉴定。结果表明,本研究建立的简单异尖线虫SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,稳定性好,可用于简单异尖线虫的鉴定。     

用FQ-PCR方法快速检测水产品中副溶血弧菌

[目的]采用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测与鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量检测试剂盒.[方法]根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线.以副溶血弧菌菌株8株及同源及非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测.同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测.[结果]该方法有良好的特异性8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其他24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,其它15株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.9871.直接进行定量检测,则检测低限在102cfu/g;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfu/g.[结论]该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景.     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.