弓形虫P30基因的克隆及其在E．coli中的融合表达

【目的】研究弓形虫P30基因的克隆及其在E．coli中的融合表达。【方法】参照弓形虫P30序列设计引物,应用PCR技术扩增出弓形虫RH株P30的部分基因,将扩增产物克隆到pUCm—T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET-30a中,得到重组质粒pET-30a—P30并将其转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Westen-blot分析。【结果】P30基因在E．coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白的分子量在30kDa附近,可以被鼠抗Toxoplasma gondii阳性血清特异性识别。【结论】该研究为Toxoplasma gondii的检测和疫苗研制及综合防制奠定了基础。     

弓形虫半巢式PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因（X14080）设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504bp片段与P30基因（X14080）的序列同源性为99.8%。该PCR检测体系的特异性强,不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为18fg。