抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

克罗诺阪崎肠杆菌微滴数字PCR定量方法的建立

为建立克罗诺阪崎肠杆菌的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)快速定量检测方法,针对克罗诺阪崎肠杆菌的特异性单拷贝PapC基因设计引物探针,进行特异性、灵敏度和重复性实验,本文通过对纯菌液进行检测,比较平板计数法、实时PCR和ddPCR...     

荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS

根据转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)基因序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针,建立一种应用荧光双链探针的实时PCR定量检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S和NOS基因成分,其余6份样品结果为阴性.结果表明本文建立的荧光PCR方法能有效检测出35S和NOS两种转基因成分,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

PCR技术在口岸传染病检测中的应用

PCR技术即聚合酶链式反应,是一种体外酶促合成特定基因或DNA片段的分子生物学技术,因其灵敏、快速、简便、特异性强等优点,现已广泛应用于多种疫源性疾病的诊断、疫情研判及感染溯源等领域。本文叙述了C-PCR、荧光定量RT-PCR、微滴式数字PCR等技术在甲型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒及新型冠状病毒中的检测运用,为口岸传染病检测提供思路PCR技术虽应用广泛,但其发展和运用受多种因素的影响有出现假阴性和假阳性结果的可能,利用实验室的质量控制手段来保证检测结果能从根本上减少误差产生的概率,从而为传染病的准确检出提供有力的保证。     

应用数字PCR对新型冠状病毒核酸检测结果的分析

比较数字PCR(dPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的结果,为利用dPCR对SARS-CoV-2含量低的样品进行核酸检测提供数据支持.利用dPCR和qPCR对济宁市17份新型冠状病毒肺炎(COVID-19)核酸样本进行N基因和ORF1ab基因检测.qPCR检测N基因1...     

多重PCR检测食品中转基因成分研究

[目的]建立检测转基因食品的多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测体系.[方法]针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件,包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因,同时选定植物本身固有的大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因,设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR,结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系,对转基因食品进行检测,1～2天能完成整个检测过程.对珠海地区市售的大豆、玉米、油菜及其加工产品共185个样品中的转基因成分进行了初步调查.[结果]建立的多重PCR检测体系稳定可靠、特异性好,灵敏度高.调查的185份可疑食品样品中,转基因阳性率达27.6%.[结论]该检测体系快速可靠、灵敏准确、特异性好,且操作简便、成本低廉,是一种进行转基因食品检测的良好的技术模式.对珠海地区的转基因食品状况有了一定了解.     

应用荧光PCR方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌

[目的]发展一种快速、敏感、特异的荧光PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌.[方法]针对单增李斯特氏菌溶血素基因(hly A),设计特异的引物和TaqMan探针,优化体系,建立荧光PCR检测方法,对该方法的特异性和敏感性进行评价,并且在对188个进出口食品样本的检测中与传统方法进行对比.[结果]经对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株检测,结果显示该方法具有良好的特异性.灵敏度检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h.在实际样本的检测中,检测结果与传统方法结果一致.[结论]该方法能快速、简便和准确地检出单核细胞增生李斯氏菌,具有良好的应用前景.     

以oprI为靶基因实时荧光PCR法检测化妆品中绿脓杆菌

建立快速检测化妆品中绿脓杆菌的实时荧光PcR方法。选取绿脓杆菌oprI基因中相对保守且高度特异的核苷酸片段作为荧光PCR扩增的靶序列,设计引物和TaqMan探针,并研究了DNA提取方法,优化扩增反应体系和仪器条件。与GB方法进行比对,检测结果一致,但检测时间均只有GB方法的1／10;方法的检测灵敏度为2cFu／荧光PcR反应体系,染菌样品经6h增菌培养后,检测低限均达到2cFu／g,证明该方法高度敏感;通过对36株标准／参考菌株和51株非目的菌的检测,证实该方法高度特异;批内cP值的变异系数小于2％,说明该方法具有良好的可重复性。     

抗病毒转基因番木瓜的实时PCR检测

番木瓜是世界上第一种大规模种植的转基因水果,多个国家和地区开展了转基因番木瓜的研究和田间试验。针对市场上可能遇到的转基因番木瓜种类,本文分析了这些转基因木瓜的外源基因结构,在外源基因的NOS启动子与植物基因组之间的侧翼序列中设计了3类转基因木瓜的4个品系（Event）的特异性实时PCR的引物/探针,建立了4种抗病毒转基因番木瓜的品系特异性实时PCR检测方法,优化了番木瓜果肉和种籽的DNA纯化方法。实验表明这些品系检测方法的特异性和灵敏度符合出入境检验检疫的要求,应用这些方法从市售的番木瓜中检出了台湾中兴大学研发的两个转基因品系。     

进境谷物中转基因油菜籽RT73的定性定量检测

[目的]转基因作物可能会以杂质的形式混入到谷物中,所以要加强对谷物中杂质的转基因成分检测.[方法]利用常规定性PCR方法和实时荧光PCR方法对来源于进境谷物中的32份转基因油菜籽样品进行了转基因油菜RT73的检测.[结果]通过常规定性PCR检测,检出28份转基因油菜籽含RT73;使用ABI 7700定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测,检出31份转基因油菜含RT73,其含量分别为0.03%～97.7%.[结论]其进出口谷物杂质中混有转基因成分,口岸检验检疫机构要加强其检测.     

实时荧光定量PCR在食品微生物检测中的应用和质量控制

通过概述实时荧光定量PCR技术的原理、特点,以及其在食品微生物检测、转基因食品等领域的应用和质量控制情况,旨在为食品安全监测提供依据。     

空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究

空肠弯曲菌是世界卫生组织列为最常见食源性传染病菌之一的人兽共患病原菌,传统的分离鉴定方法需要耗费大量工时,并存在敏感性低、难以检出非可培养状态细菌和易出现假阴性结果等问题.本研究首创了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR快速检测方法,无需增菌培养即可直接捕获检样中的弯曲菌,利用实时荧光PCR进行鉴定,可在24h内完成检测,检测低限达到10cfu/mL,提高了非可培养状态空肠弯曲菌的检出率.     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。     

贵阳市三文鱼转基因成分检测调查

目的:对2017年贵阳市在售的进口三文鱼进行抽样检测,在省内首先实践相关检测技术,为市场监督和管理部门提供参考。方法:由贵州省产品质量监督检验院专业抽样人员进行随机抽样,餐饮、散装、包装各10批次,通过荧光PCR法进行检测,所用引物和探针根据转基因三文鱼AquAdvantage公开序列进行设计。结果:未检出含有转基因成分的样品批次。结论:目前转基因三文鱼尚未大规模进入当地市场。     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

目的:弗尼斯弧菌(Vibrio fumissii)是引起世界范围内胃肠功能紊乱的致病菌之一,一般通过摄人生的或者未煮熟的水产品进行传播。本研究旨在建立高效、可靠的PCR检测方法应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。方法和结果:根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计普通PCR引物及实时PCR引物、探针,建立普通PCR和实时荧光PCR方法,分别对两种方法的特异性和灵敏度进行比较分析,同时应用于384份食品样品检测。结果表明,建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为:2.4×10^3 CFU/ml和24 CFU/ml,并于5 h内完成整个检测过程,同时对384份食品进行检测,共检出6株阳性菌株。结论:本研究建立的PCR检测技术灵敏度高、特异性好,可应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。     

荧光定量PCR技术及其在动物检疫中的应用

荧光定量PCR技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术．具有能实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、特异性好等优点,已广泛应用于医学和生物学领域。本文主要对荧光定量PCR技术在动物检疫领域的应用进行综述。     

SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病

[目的]利用SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病.[方法]根据传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)Y10404的序列合成部分基因片段,将其插入到T载体中,构建阳性质控品;并设计合成一对特异性引物.利用阳性质控品建立SYBR-Green Ⅰ实时荧光PCR方法,对反应体系进行优化,进行特异性和敏感性分析,并制作标准曲线.[结果]最佳引物终浓度为0.51μmol/L.所建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法能够特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5× 10-8 μg/μL,其灵敏度比传统PCR高1000倍;能够从阳性样品中检出ISAV,Tm值为82.5℃.建立了标准曲线,其r2＞0.99.     

一步法实时荧光RT-PCR在疟原虫检测中的应用

本研究探讨了用一步法实时荧光RT-PCR检测疟原虫核酸的可行性。分别用一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR两种扩增方法对不同稀释度的样本总RNA和基因组DNA进行检测,同时对20份疟原虫阳性血样进行检测。结果显示,一步法实时荧光RT-PCR可检测到的稀释度最高,比实时荧光PCR高1000倍。运用一步法实时荧光RT-PCR方法检测出20份全部阳性样本,检出率为100%;实时荧光PCR方法检测出18份阳性样本,检出率为90%。结果表明,一步法实时荧光RT-PCR方法用于疟原虫检测比实时荧光PCR方法更具有优势,敏感性更强,准确性更高。     

嗜肺军团菌血清1型荧光PCR检测方法的研究

本研究利用嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因,设计并筛选出一对实时荧光PCR引物和Taq Man探针,建立了嗜肺军团菌血清1型(Lp1)实时荧光PCR检测方法。特异性试验显示,3株Lp1出现了典型的扩增曲线,23株近源参考菌株没有扩增。灵敏度试验显示,水中Lp1的检测底线可达到1.1×10² CFU/mL。重复性试验结果显示,高、中、低浓度扩增Ct值相对标准偏差分别为0.51%、0.42%、0.31%。结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、重复性好、检测流程短,适于水环境污染状况调查及应急事件快速检测。