荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断西尼罗病毒感染的胶体金免疫层析试纸条方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记西尼罗病毒NS1蛋白,采用双抗原夹心法制备胶体金免疫层析试纸条,对试纸条进行特异性和敏感性评价。[结果]该试纸条可在15min之内完成检测;在敏感性上,该试纸条对阳性血清的检测较美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒检测低1个滴度;对89份阴性血清进行检测,试纸条检出9份阳性,ELISA试剂盒检出3份阳性,两种检测的符合率为86.52%,特异性为89.89%。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测西尼罗病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。     

西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究

[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析。[方法]将WNV NS1基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pET30a-WNV-NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行SDS-PAGE和W estern-blot分析,经N i＋亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作ELISA检测。将重组蛋白包板,检测FOCUS公司商品化试剂盒中的阳性血清。[结果]（1）重组WNV NS1蛋白获得表达并纯化成功。（2）Western blot结果显示表达的蛋白是带有H is标签的目的蛋白。（3）兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1：50000以上。（4）检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2。[结论]重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础。     

磺胺-5-甲氧嘧啶酶联免疫分析试剂盒的研制与应用

[目的]建立动物食品中残留磺胺-5-甲嘧啶的检测方法.[方法]用戊二醛法将磺胺-5-甲嘧啶(SMD)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白OVA)偶联.用紫外分光光度计进行扫描鉴定.以制备的SMD-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与骨髓细胞(SP2/0-Ag14)融合,制备腹水,获得高效价的抗体.[结果]建立了间接竞争ELISA的测定方法,检测限为1.766ng/mL,定量限为11.274ng/mL.用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原,做ELISA实验,结果显示抗体与这8种磺胺药没有交叉反应.制备了检测试剂盒,在肌肉、肝脏的样本中加入50ng/mL,100ng/mL做添加回收实验,回收率为87.45%～97.6%,变异系数为3.35%.[结论]本方法的检测限能够满足动物源性食品中SMD残留检测的要求,试剂盒灵敏度高,稳定性好,使用方便,适于基层大规模筛选.     

磺胺-5-甲氧嘧啶酶联免疫分析试剂盒的研制与应用

[目的]建立动物食品中残留磺胺-5-甲嘧啶的检测方法.[方法]用戊二醛法将磺胺-5-甲嘧啶(SMD)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白OVA)偶联.用紫外分光光度计进行扫描鉴定.以制备的SMD-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与骨髓细胞(SP2/0-Ag14)融合,制备腹水,获得高效价的抗体.[结果]建立了间接竞争ELISA的测定方法,检测限为1.766ng/mL,定量限为11.274ng/mL.用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原,做ELISA实验,结果显示抗体与这8种磺胺药没有交叉反应.制备了检测试剂盒,在肌肉、肝脏的样本中加入50ng/mL,100ng/mL做添加回收实验,回收率为87.45%～97.6%,变异系数为3.35%.[结论]本方法的检测限能够满足动物源性食品中SMD残留检测的要求,试剂盒灵敏度高,稳定性好,使用方便,适于基层大规模筛选.     

PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

荧光RT—PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液,并同时与鸡胚病毒分离比较表明,荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,最低为10-5,略低于鸡胚病毒分离.对23株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出,本课题建立的荧光RT-PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒.用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒,未发现交叉反应.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.     

口蹄疫病毒3AB克隆表达及其抗体间接ELISA检测方法建立与应用研究

采用重叠PCR方法人工合成3AB基因片段,将其克隆到PET-28a＋载体,转化导入宿主菌BL21（DE3）中成功表达,获得大小约为33Ku的重组表达蛋白。以纯化的重组表达蛋白为抗原,建立了检测猪FMDV3ABNSP抗体的间接ELISA方法。将本方法与进口口蹄疫非结构蛋白3ABC阻断ELISA试剂盒进行比较,结果显示,本方法可以用于区分猪口蹄疫自然感染动物与疫苗免疫动物。     

自制麻痹性贝毒GTX2，3单克隆抗体在直接竞争酶免疫学检测方法中的初步应用

【目的】建立麻痹性贝类毒素GTX2,3直接竞争酶免疫学检测方法（de-ELISA）。【方法】通过过氧化反应将GTX2,3与辣根过氧化物酶HRP偶联,利用适当稀释的兔抗小鼠IgG多抗作为包被抗体,利用GTX2,3作为竞争剂与GTX2,3-HRP竞争结合自制GTX2,3的单克隆抗体,初步建立检测麻痹性贝类毒素GTK2,3的de-ELISA,并用直接竞争ELISA检测该方法与C2毒素之间的交叉反应。【结果】直接ELISA结果显示GTX2,3与HRP发生过氧化反应,de-ELISA检测麻痹性贝类毒素时,该方法的灵敏度为1μg／mL,工作范围为1-40μg／mL,该方法与C2毒素无交叉反应。【结论】初步建立的dc-ELISA适用于麻痹性贝类毒素的快速检测,为其酶免疫学快速检测试剂盒的研制奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究

空肠弯曲菌是世界卫生组织列为最常见食源性传染病菌之一的人兽共患病原菌,传统的分离鉴定方法需要耗费大量工时,并存在敏感性低、难以检出非可培养状态细菌和易出现假阴性结果等问题.本研究首创了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR快速检测方法,无需增菌培养即可直接捕获检样中的弯曲菌,利用实时荧光PCR进行鉴定,可在24h内完成检测,检测低限达到10cfu/mL,提高了非可培养状态空肠弯曲菌的检出率.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病

[目的]利用SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病.[方法]根据传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)Y10404的序列合成部分基因片段,将其插入到T载体中,构建阳性质控品;并设计合成一对特异性引物.利用阳性质控品建立SYBR-Green Ⅰ实时荧光PCR方法,对反应体系进行优化,进行特异性和敏感性分析,并制作标准曲线.[结果]最佳引物终浓度为0.51μmol/L.所建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法能够特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5× 10-8 μg/μL,其灵敏度比传统PCR高1000倍;能够从阳性样品中检出ISAV,Tm值为82.5℃.建立了标准曲线,其r2＞0.99.     

应用荧光RT-PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

应用荧光RT—PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

岩沙海葵毒素直接酶联免疫吸附检测方法的研究

[目的]制备岩沙海葵毒素(PTX)多抗血清,纯化并标记辣根过氧化物酶,建立PTX多克隆直接酶联免疫吸附检测方法.[方法]将纯品毒素PTX与大分子蛋白质匙眼血蓝蛋白(KLH)分别巯基化,用化学法偶联二者成为半抗原,以其诱导BALB/c小鼠产生多价抗血清;以辣根过氧化物酶(HRP)标记PTX多抗血清;以PTX纯毒素作为包被抗原,HRP标记的多价抗血清为酶标抗体,建立PTX多抗直接ELISA检测方法.[结果]制备的抗PTX多价抗血清,经纯化后与HRP标记成功;建立的PTX多抗直接ELISA检测法,其最佳工作浓度为180.[结论]本研究制备的PTX人工免疫抗原具有较高的特异性和免疫原性,多克隆抗体为特异性抗PTX抗体,PTX多抗直接ELISA检测法对PTX的检测可达到5～10ug水平,该法应用于海产品中PTX快速检测的结果,待进一步研究.     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Yvein necrosis strain,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本研究根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP）基因序列保守区域,设计合成了两对巢式PCR引物和一条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Real-time PCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Real time PCR等方法高。该方法检测灵敏度可达3 fg/μL植物总RNA。利用四对引物和一条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,检测的准确性比其它方法高。     

气相色谱法测定茶叶中二硫代氨基甲酸酯总残留量

本文建立了气相色谱法(GC-ECD)测定茶叶中二硫代氨基甲酸酯总残留量的方法.茶叶在密闭系统中与还原性酸溶液反应,含二硫代氨基甲酸酯的物质被分解,定量释放出二硫化碳,取反应液上方气体用气相色谱法测定二硫化碳含量,外标法定量.以HP-50+(Crosslinked 50%Ph Me Silicone,30m×0.53mm×1.0μm)毛细管柱为分离柱,选择出合适的色谱条件.本方法对茶叶样品的检测低限可达0.1mg/kg,添加浓度为0.1～1.0mg/kg时,回收率为83%～93%;相对标准偏差为2.6%～5.6%.