实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒

对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）感染引起,所有养殖对虾对该病高度易感,蟹类、小龙虾、淡水虾以及各种龙虾也易感,但发病率和死亡率有很大差别。多种虾类常表现为持续感染或终身隐性感染。隐性感染虾体内的病毒含量极低,需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法。本文应用TaqMan探针技术设计了探针和引物,建立了检测WSSV的实时荧光定量PCR方法。对影响PCR反应的主要因素Mg^2＋浓度和退火温度等进行了优化,证明当Mg2＋浓度为3.5～4.0 mmol,退火温度为59～60℃时可获得最佳的扩增和检测效果。     

检测猪传染性胃肠炎病毒RT—PCR方法的建立

[目的]建立对猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学调查提供可靠的和敏感的手段.[方法]根据Genbank收录的TGEV-Miller毒株S蛋白的基因序列,设计合成一对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.[结果]两条引物扩增目的片段长度为1262bp.经测序分析,与Miller毒株的同源性为99.1%.[结论]该RT-PCR方法灵敏,可靠,具有很强的临床检测意义,可用于TGEV的快速诊断和流行病学调查.     

五种血清型柯萨奇病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

在柯萨奇病毒基因组VP1区设计引物和探针,分别建立了特异性检测5种血清型（A9、A16、B2、B3和B5型）柯萨奇病毒（Coxsackievirus）基于MGB探针的实时荧光RT-PCR方法。通过构建的分别适于5种血清型病毒检测的质粒标准分子对建立的检测体系进行了灵敏度分析,确定5种血清型柯萨奇病毒检测体系的检测下限均为2拷贝质粒标准分子DNA。     

猪传染性胃肠炎预防和治疗措施

本文首先分析了病原学及流行病学,接着分析了临床症状,最后对猪传染性胃肠炎的和治疗措施进行了探讨.希望能够为相关人员提供有益的参考和借鉴.     

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性.表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒.但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性.推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解.     

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

应用荧光RT-PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限最低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。     

三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的研究

鱼传染性造血器官坏死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus IHNV）、鱼病毒性出血性败血症病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus VHSV）和鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus SVCV）是同属弹状病毒科（Rhabdoviridae）的3种鱼类病毒,也是影响水产养殖业的3种重要病毒。通过对这3种病毒基因序列的分析,在病毒基因的高保守区域,设计了3条分别针对这3种病毒的Taqman MGB探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。以此为基础建立针对该3种病毒的三重实时荧光RT-PCR的检测方法。通过反应条件的优化,该三重实时荧光RT-PCR最低可检测至102拷贝/反应的病毒量。同时,该方法还对病毒混合感染EPC细胞（Epithelioma papulosum cyprini）和攻毒斑马鱼进行了检测。实验结果表明,该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法。     

昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT—PCR检测方法的建立

[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7．0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限：昆津病毒1．83106copies／μL,巴马哈森林病毒2．02×106copies／μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

应用荧光PCR方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌

[目的]发展一种快速、敏感、特异的荧光PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌.[方法]针对单增李斯特氏菌溶血素基因(hly A),设计特异的引物和TaqMan探针,优化体系,建立荧光PCR检测方法,对该方法的特异性和敏感性进行评价,并且在对188个进出口食品样本的检测中与传统方法进行对比.[结果]经对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株检测,结果显示该方法具有良好的特异性.灵敏度检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h.在实际样本的检测中,检测结果与传统方法结果一致.[结论]该方法能快速、简便和准确地检出单核细胞增生李斯氏菌,具有良好的应用前景.     

BioLumix微生物实时荧光光电检测系统快速检测食品中致病菌的应用研究

食品微生物致病菌是食品质量的重要指标,本文将一种微生物荧光光电检测系统与传统国家标准检验方法在检测金黄色葡萄球菌上进行比较,得出了两种方法检测结果一致的结论,但是该检测系统相对于传统检测方法具有检测时间短、操作简单、可自动显示结果等优点。     

原子荧光法检测火锅料中的砷

本文通过对4个品牌的火锅底料进行砷含量的测定,并且通过实验了解市售火锅料中的砷含量情况。利用原子荧光检测测定制定样品中的砷,1个样品测4次,一共做了16次实验。得到的砷含量线性回归方程为:Y=303.35x-25.9。并且还分别测定出了4种火锅料中的砷含量,分别为A砷含量为0.86 mg/kg,B砷含量为0.52 mg/kg,c砷含量为0.13 mg/kg,D砷含量为0.33 mg/kg。不同品牌火锅料中的砷含量不同,尽量选择正规渠道购买火锅料。     

定量检测SARS-CoV N蛋白的悬浮芯片方法研究

利用悬浮芯片技术,建立定量检测SARS-CoV N蛋白的悬浮芯片方法。用抗体包被编码微球作为反应载体,双抗体夹心法为反应模式,建立了SARS冠状病毒悬浮芯片检测方法,通过盲样和实验室标准检测等评估,表明适用于现场样品的检测。检测SARS冠状病毒N蛋白的灵敏度为4.86 ng/mL,在4.86-25600 ng/mL浓度范围内具有良好的动力学响应特性,比ELISA方法有较高的灵敏度和较宽动态检测范围。在早期识别、快速诊断和应对生物恐怖威胁、传染病暴发中具有广阔的应用前景。     

快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断西尼罗病毒感染的胶体金免疫层析试纸条方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记西尼罗病毒NS1蛋白,采用双抗原夹心法制备胶体金免疫层析试纸条,对试纸条进行特异性和敏感性评价。[结果]该试纸条可在15min之内完成检测;在敏感性上,该试纸条对阳性血清的检测较美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒检测低1个滴度;对89份阴性血清进行检测,试纸条检出9份阳性,ELISA试剂盒检出3份阳性,两种检测的符合率为86.52%,特异性为89.89%。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测西尼罗病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。