3种花卉基固组DNA的提取及转基因成分的PCR检测

采用CTAB微量法和试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA,试剂盒提取的效果较好.设计合成了3对引物,分别扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS!)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因.PCR检测结果表明,3种花卉中仅矮牵牛的一个样品为阳性,含有这3种转基因成分,酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性.     

3种花卉基因组DNA的提取及转基因成分的PCR检测

采用CTAB微量法和试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA,试剂盒提取的效果较好.设计合成了3对引物,分别扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS!)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因.PCR检测结果表明,3种花卉中仅矮牵牛的一个样品为阳性,含有这3种转基因成分,酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性.     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

多重PCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

建立快速检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR(MPCR)方法.针对古典型霍乱弧菌(CVC)和埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的共有序列霍乱肠毒素基因(ctxB)、CVC的毒力协调A亚单位基因(C-tcpA)、EVC的毒力协调A亚单位基因(E-tcpA)、副溶血性弧菌的热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列设计引物,建立多重PCR检测方法,相应扩增片段依次为564bp、617bp、471bp和202bp.用该方法检测EVC、CVC、副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、沙门氏菌等35株菌株表现出极好的特异性,对人工污染的罗非鱼、小虾、牡蛎、鱼鳃和鱼肠混合物的检出限EVC为2.2 cfu/mL、CVC为2.8 cfu/mL、副溶血性弧菌为6.5 cfu/mL,扩增片段表现出极好的特异性,整个实验过程8～10h完成.实验结果表明该方法是特异性强、省时、省力的检测方法.     

多重PCR检测食品中转基因成分研究

[目的]建立检测转基因食品的多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测体系.[方法]针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件,包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因,同时选定植物本身固有的大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因,设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR,结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系,对转基因食品进行检测,1～2天能完成整个检测过程.对珠海地区市售的大豆、玉米、油菜及其加工产品共185个样品中的转基因成分进行了初步调查.[结果]建立的多重PCR检测体系稳定可靠、特异性好,灵敏度高.调查的185份可疑食品样品中,转基因阳性率达27.6%.[结论]该检测体系快速可靠、灵敏准确、特异性好,且操作简便、成本低廉,是一种进行转基因食品检测的良好的技术模式.对珠海地区的转基因食品状况有了一定了解.     

应用数字PCR对新型冠状病毒核酸检测结果的分析

比较数字PCR(dPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的结果,为利用dPCR对SARS-CoV-2含量低的样品进行核酸检测提供数据支持.利用dPCR和qPCR对济宁市17份新型冠状病毒肺炎(COVID-19)核酸样本进行N基因和ORF1ab基因检测.qPCR检测N基因1...     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯黑环斑病毒的研究

马铃薯黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）是马铃薯重要病毒病害之一。本研究根据PBRSV基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）保守序列,设计合成了两对巢式PCR引物和1条Taq-MAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Realtime PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM试剂盒快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达450fg/μL植物总RNA。利用4对引物和1条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。     

产志贺毒素大肠杆菌的分子生物学检测方法研究

[目的]建立快速准确检测食品中产志贺毒素大肠杆菌的分子生物学方法.[方法]针对产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因,设计了4对特异性引物.[结果]采用多重PCR(multiplexPCR)方法,得到614bp、779bp、450bp和300bp 4条片断.[结论]实验结果表明,本文建立的mPCR方法较常规的大肠杆菌检测方法简便、快速、灵敏度高,灵敏度可达15cfu/mL.     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Yvein necrosis strain,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本研究根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP）基因序列保守区域,设计合成了两对巢式PCR引物和一条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Real-time PCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Real time PCR等方法高。该方法检测灵敏度可达3 fg/μL植物总RNA。利用四对引物和一条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,检测的准确性比其它方法高。     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

设计合成2对PCV型特异性引物,其中C1、C2扩增PCV1和PCV2共有的938bp特异性片段,C3、C4只扩增PCV2特异性的490bp片段.在对该多重PCR的反应条件进行优化后,建立了猪圆环病毒多重PCR诊断方法,既可对PCV进行定性检测,又可对PCV1和PCV2进行定型,便于口岸检疫和养殖场的临床诊断.     

多重荧光PCR方法检测食品中致病菌的实用研究

目的:验证多重荧光PCR方法在食品中致病菌检测的实用性,并为标准制定提供参考。方法:以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌为测试对象,设立阳性、阴性、空白样品对照,以GB4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016为方法对照,设计引物和探针对样品进行检测。结果:多重荧光PCR方法的阳性、阴性、空白样品对照结果准确,检测结果与上述国标一致。结论:采用荧光PCR方法,可大幅缩短食品中致病菌的检测时间,且操作简便,具有一定的实用价值。     

数字PCR及荧光定量PCR测定豆乳饮料转基因成分分析

研究将转基因启动子CaMV35s、终止子NOS基因作为靶标,内标选择大豆内源基因Lectin,分别采用微滴式数字PCR及实时荧光PCR对标准品转基因大豆进行检测,实测20批次豆乳饮料转基因成份。结果显示,与实时荧光PCR相比,微滴式数字PCR对转基因筛查浓度检测低限、含量低限均较低,分别为0.04 ng/反应、0.05%,与欧盟转基因标识阈值要求符合。20批次样品中有16批次经过不同平台检测结果为阴性,1批次为阳性,3批次经过数字PCR检测获得准确结果,表明该检测技术能对实时荧光PCR起到辅助检测作用。     

利用IMS／PCR方法快速检测食品中单增李斯特菌

研究用免疫磁珠(1mmunomagnetic separation,IMS)和复合PCR(multiplex-PCR)联用方法,从样品中直接浓缩获取单增李斯特菌(Listeria monocytogenes).针对L.monocytogenes的Listeriolysin O基因和李斯特菌属的23S rRNA设计两对特异性引物,作为Polymerase Chain Reaction(PCR)的靶基因,经PCR反应分别得到700bp和240bp.用IMS/PCR方法和SN方法同时检测了样品162份,结果通过API方法确证,符合率达到100%.结果表明,本文建立的IMS/PCR方法较常规方法简便、快速、灵敏度高,灵敏度可达1.5CFU/mL,在24h可快速检出L.monocytogenes,有很好的应用前景和研究价值.     

SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病

[目的]利用SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病.[方法]根据传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)Y10404的序列合成部分基因片段,将其插入到T载体中,构建阳性质控品;并设计合成一对特异性引物.利用阳性质控品建立SYBR-Green Ⅰ实时荧光PCR方法,对反应体系进行优化,进行特异性和敏感性分析,并制作标准曲线.[结果]最佳引物终浓度为0.51μmol/L.所建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法能够特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5× 10-8 μg/μL,其灵敏度比传统PCR高1000倍;能够从阳性样品中检出ISAV,Tm值为82.5℃.建立了标准曲线,其r2＞0.99.     

蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子“病病原鉴定中的应用

在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患“红脖子“的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属.     

蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子”病病原鉴定中的应用

在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患"红脖子"的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属.     

嗜肺军团菌血清1型荧光PCR检测方法的研究

本研究利用嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因,设计并筛选出一对实时荧光PCR引物和Taq Man探针,建立了嗜肺军团菌血清1型(Lp1)实时荧光PCR检测方法。特异性试验显示,3株Lp1出现了典型的扩增曲线,23株近源参考菌株没有扩增。灵敏度试验显示,水中Lp1的检测底线可达到1.1×10² CFU/mL。重复性试验结果显示,高、中、低浓度扩增Ct值相对标准偏差分别为0.51%、0.42%、0.31%。结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、重复性好、检测流程短,适于水环境污染状况调查及应急事件快速检测。     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。     

食品中单增李斯特菌快速、敏感、特异PCR检测方法的建立

[目的]建立食品中单增李斯特菌的PCR检测方法.[方法]根据单增李斯特菌的hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因各设计了一对引物,两对引物组合建立PCR方法,用人工污染食品对该方法进行验证,于37℃经24h预增菌和24h增菌后直接进行PCR分析.[结果]在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中单增李斯特菌的检出限为1cfu/25g(mL),在原奶和生肉中的检出限分别为1～10 cfu/25mL和25 cfu/25g.[结论]该方法快速、敏感、特异,适合不同类型食品的常规检测分析,可用于食品工业中单增李斯特菌的检测.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.