中强毒力新城疫病毒（NDV）荧光RT—PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针,从中筛选出最佳引物、探针配对,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT-PCR.     

鸡新城疫病毒强弱毒株RT—PCR鉴别诊断方法

本研究通过对不同毒力的新城疫病毒(NDV)的融合蛋白基因(F基因)核苷酸序列分析,根据毒力和序列间的相关规律,分别设计出3对引物P1+P2,P1+P3,P1+P4,建立了一种可以迅速鉴定新城疫病毒并且同时鉴别毒株毒力强弱的RT-PCR方法.引物P1+P2能特异性地对所有新城疫病毒可扩增出一条362bp的片段,引物P1+P3能特异性地针对所有新城疫强毒株扩增出一条254bp的片段,引物P1+P4能特异性地针对所有新城疫弱毒株扩增出一条254bp的片段,整个试验过程可在6小时内完成.对实验室分离的4株病毒进行检测,结果同常规检测方法的结果一致.     

荧光RT—PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用6株新城疫病毒分离株人工感染28日龄肉鸡,感染后3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子,对死亡鸡进行病理剖检,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等,制备组织脏器悬液,作倍比稀释,用建立的荧光RT-PCR方法检测并同鸡胚分离比较.试验表明,荧光RT-PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致,荧光RT-PCR检测脏器的最低检测量为5X10-5,肌肉的最低检测量为5X10-3,拭子的最低检测量为10-3.用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT-PCR表明,裂解液处理样品方法优越,可提高检测灵敏度.     

荧光RT—PCR在临床检测的应用

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒的方法检测了5批临床样品,其中有禽肉、鸡咽喉拭子/泄殖腔拭子、鸽泄殖腔拭子,其中检出3份样品中有中强毒力新城疫病毒,用鸡胚分离方法并经毒力鉴定证实了检测结果的准确性.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT—PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中.本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT-PCR检测的方法.     

昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT—PCR检测方法的建立

[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7．0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限：昆津病毒1．83106copies／μL,巴马哈森林病毒2．02×106copies／μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。     

应用荧光RT—PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性.表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒.但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性.推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解.     

猪流行性腹泻病毒套式RT—PCR检测方法的建立及初步应用

[目的] 建立PEDV的新型套式RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段.[方法] 根据Genbank已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的基因序列,设计合成两对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测PEDV的新型套式RT-PCR方法,并用该方法对PEDV进行了快速诊断和分析.[结果] 外引物扩增目的片段长度为1328bp,内引物扩增目的片段为540bp.[结论] 该套式RT-PCR方法比普通RT-PCR更加灵敏、可靠,可用于PEDV的快速诊断和流行病学调查.     

应用荧光RT-PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

应用RT—PCR检测灭活疫苗中口蹄疫病毒（核酸）

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测口蹄疫灭活疫苗中的病毒RNA.设计相应于病毒基因组VP1序列保守区段20mer长度的引物.分离出灭活疫苗水相,萃取总RNA,反转录合成cDNA,进行PCR扩增和电泳检测扩增产物,本引物对扩增片段长度483bp,并设计一个Marker作为对照.     

检测猪传染性胃肠炎病毒RT—PCR方法的建立

[目的]建立对猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学调查提供可靠的和敏感的手段.[方法]根据Genbank收录的TGEV-Miller毒株S蛋白的基因序列,设计合成一对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.[结果]两条引物扩增目的片段长度为1262bp.经测序分析,与Miller毒株的同源性为99.1%.[结论]该RT-PCR方法灵敏,可靠,具有很强的临床检测意义,可用于TGEV的快速诊断和流行病学调查.     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

五种血清型柯萨奇病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

在柯萨奇病毒基因组VP1区设计引物和探针,分别建立了特异性检测5种血清型（A9、A16、B2、B3和B5型）柯萨奇病毒（Coxsackievirus）基于MGB探针的实时荧光RT-PCR方法。通过构建的分别适于5种血清型病毒检测的质粒标准分子对建立的检测体系进行了灵敏度分析,确定5种血清型柯萨奇病毒检测体系的检测下限均为2拷贝质粒标准分子DNA。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.     

三种禽用疫苗外源病原多重荧光PCR检测方法建立

根据GenBank中收录的鸡毒支原体、禽白血病病毒和网状内皮细胞增生症病毒的基因序列,分别设计并合成了引物和相应的荧光探针,通过对反应条件和反应程序的优化,建立了一种可以同时检测3种禽用疫苗外源性病原污染因子的三重荧光PCR检测方法。结果显示,建立的三重荧光PCR灵敏度高,最低可检测到10 copies/μL的质粒,并具有良好的特异性,可用于禽用疫苗外源性污染因子的快速检测,也可用于相关疫病的诊断。     

实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒

对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）感染引起,所有养殖对虾对该病高度易感,蟹类、小龙虾、淡水虾以及各种龙虾也易感,但发病率和死亡率有很大差别。多种虾类常表现为持续感染或终身隐性感染。隐性感染虾体内的病毒含量极低,需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法。本文应用TaqMan探针技术设计了探针和引物,建立了检测WSSV的实时荧光定量PCR方法。对影响PCR反应的主要因素Mg^2＋浓度和退火温度等进行了优化,证明当Mg2＋浓度为3.5～4.0 mmol,退火温度为59～60℃时可获得最佳的扩增和检测效果。