应用荧光RT-PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性.表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒.但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性.推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解.     

常用禽流感检测技术及其在检验检疫领域中的应用

通过对目前常用的禽流感检测技术如琼脂凝胶扩散试验(AGP)、血细胞凝集抑制试验(HI)、鸡胚病毒分离试验、FLISA方法、免疫荧光技术、RT-PCR技术和荧光RTPCR技术等试验方法和技术收集和分析,以及这些技术在检验检疫领域的应用,探讨了这些方法的优缺点和在检验检疫领域应用的实用性.最后重点介绍了在检验检疫领域最具有应用优势的荧光RT-PCR方法检测禽流感的技术.     

荧光RT—PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液,并同时与鸡胚病毒分离比较表明,荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,最低为10-5,略低于鸡胚病毒分离.对23株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出,本课题建立的荧光RT-PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒.用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒,未发现交叉反应.     

BioLumix微生物实时荧光光电检测系统快速检测食品中致病菌的应用研究

食品微生物致病菌是食品质量的重要指标,本文将一种微生物荧光光电检测系统与传统国家标准检验方法在检测金黄色葡萄球菌上进行比较,得出了两种方法检测结果一致的结论,但是该检测系统相对于传统检测方法具有检测时间短、操作简单、可自动显示结果等优点。     

荧光RT—PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用6株新城疫病毒分离株人工感染28日龄肉鸡,感染后3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子,对死亡鸡进行病理剖检,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等,制备组织脏器悬液,作倍比稀释,用建立的荧光RT-PCR方法检测并同鸡胚分离比较.试验表明,荧光RT-PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致,荧光RT-PCR检测脏器的最低检测量为5X10-5,肌肉的最低检测量为5X10-3,拭子的最低检测量为10-3.用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT-PCR表明,裂解液处理样品方法优越,可提高检测灵敏度.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.     

荧光RT—PCR在临床检测的应用

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒的方法检测了5批临床样品,其中有禽肉、鸡咽喉拭子/泄殖腔拭子、鸽泄殖腔拭子,其中检出3份样品中有中强毒力新城疫病毒,用鸡胚分离方法并经毒力鉴定证实了检测结果的准确性.     

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

一步法实时荧光RT-PCR在疟原虫检测中的应用

本研究探讨了用一步法实时荧光RT-PCR检测疟原虫核酸的可行性。分别用一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR两种扩增方法对不同稀释度的样本总RNA和基因组DNA进行检测,同时对20份疟原虫阳性血样进行检测。结果显示,一步法实时荧光RT-PCR可检测到的稀释度最高,比实时荧光PCR高1000倍。运用一步法实时荧光RT-PCR方法检测出20份全部阳性样本,检出率为100%;实时荧光PCR方法检测出18份阳性样本,检出率为90%。结果表明,一步法实时荧光RT-PCR方法用于疟原虫检测比实时荧光PCR方法更具有优势,敏感性更强,准确性更高。     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

中强毒力新城疫病毒（NDV）荧光RT—PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针,从中筛选出最佳引物、探针配对,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT-PCR.     

7种甲型H1N1流感病毒核酸检测方法的比较和验证

[目的]比较和验证7种甲型H1N1流感病毒核酸检测方法,筛选出可用于实验室日常检测的方法,并证实实验室具有正确操作这些方法的能力。[方法]应用7种方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,包括5种SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法和2种Taqman探针荧光RT-PCR法的商业试剂盒,用于方法比较和验证的参考样品包括猪流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、能力验证样品等不同来源的核酸。[结果]2种预期用于猪流感H1N1病毒核酸检测的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法均能达到预期目的;3种预期用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸检测的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法均无法区分2009年新甲型H1N1流感病毒核酸和猪流感H1N1病毒核酸;2种Taqman探针荧光RT-PCR试剂盒均能正确检出2009年新甲型H1N1流感病毒核酸,但只有1种可检出能力验证阳性样品。[结论]5种SYBRGreen Ⅰ荧光RT-PCR法中有2种能用于猪流感H1N1病毒核酸的检测,另外3种不能用于新甲型H1N1流感病毒核酸的检测;2种Taqman探针荧光RT-PCR法的商业试剂盒能用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸的检测。     

结核菌快速检测方法用于口岸检疫的研究

[目的]评价两种结核菌快速检测方法在口岸卫生检疫中的应用价值。[方法]以＂中华人民共和国行业标准-肺结核诊断标准WS288-2008＂选取结核病人100例,有呼吸道症状的疑似病人50例,以罗氏L-J固体培养结果为标准,考核荧光实时定量PCR（RT-PCR）、分枝杆菌直接检测（MDT）在结核病诊断的敏感性、特异性。[结果]100例结核病人标本培养后均为阳性,50例可疑者标本培养后均为阴性;100例培养阳性的标本,荧光实时定量PCR检测出98例阳性,MDT检测出100例阳性;50例培养阴性标本,荧光实时定量PCR检测出1例阳性,MDT未检测阳性。RT-PCR的敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值为98.04%、98.04%、99.01%、96.15%;MTD检测敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值均为100%。[结论]与传统培养方法相比较,两种方法有着很高的敏感性和特异性,但检测时间大大缩短,适合应用于口岸卫生检疫中。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

改良型与传统型免疫亲和柱净化-荧光光度法检测黄曲霉毒素的比较研究

以高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素作为确证方法,采用改良型免疫亲和柱净化-荧光光度检测技术检测花生及花生制品中的黄曲霉毒素,并与传统型免疫亲和柱净化-荧光光度法进行比较。结果表明：改良型免疫亲和柱净化-荧光光度检测技术具有更好的准确性（检测两个阳性质控样品的标准偏差分别为0.15和1.28）和精密度（相对标准偏差分别为6.65%和8.97%）;在与HPLC方法进行比较时,具有良好的一致性;检测两个加标空白花生样品的回收率分别为102.20%和101.75%。另外,与传统型免疫亲和柱净化-荧光光度法比较,改良型免疫亲和柱净化-荧光光度检测技术操作更为简便,检测时间由传统的25min缩短至10min,大大提高了检测效率。     

鲤春病快速诊断技术的临床应用

本文在建立的鲤春病病毒荧光RT-PCR快速检测技术基础上,对国内外收集的19株SVCV病毒悬液进行了验证试验,验证结果良好.另外,还通过人工动物感染试验,将感染SVC病毒的鲤鱼组织样品在同经典的细胞培养分离病毒方法对比研究后,认为应用该方法检测SVCV的组织研磨样品悬液时,最多能将3尾鱼的组织器官混合后制备待检样品.本文还用本实验室制备的SVCV单抗.运用间接免疫荧光抗体技术(IFAT)对SVCV欧洲株和亚洲株感染的鲤鱼上皮瘤细胞进行检测,结果表明,该抗体可特异性检出接毒后感染细胞中的SVCV欧洲株和亚洲株,表明应用该单抗可以检测出SVCV的欧洲株或亚洲株,不会造成漏检现象.     

检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的正向基因芯片的制备

通过分析比较禽流感病毒H5、H7和H9亚型不同毒株的基因组序列,设计出H5、H7和H9亚型特异性引物与探针,将扩增产物点制在芯片上,分别用H5、H7和H9亚型特异性探针与芯片杂交,研制出用于禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测的正向杂交基因芯片,同时对正向基因芯片进行特异性、敏感性试验,并用该方法对待检样品进行了检测。结果表明,禽流感病毒正向基因芯片与新城疫病毒、传支病毒等6种禽类常见病毒无反应,其敏感性高于常规PCR方法。     

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT—PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中.本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT-PCR检测的方法.