以腺病毒为载体的基因疗法

C种类人类腺病毒血清型2（Ad2）和5（Ad5）载体拥有很多特点,从而使它们被广泛应用于体外与体内的基因传递中。本文叙述了腺病毒极其载体的生物学特性,腺病毒质粒的设计、载体的构建、生产及纯化,以及腺病毒载体的应用。     

多重PCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

建立快速检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR(MPCR)方法.针对古典型霍乱弧菌(CVC)和埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的共有序列霍乱肠毒素基因(ctxB)、CVC的毒力协调A亚单位基因(C-tcpA)、EVC的毒力协调A亚单位基因(E-tcpA)、副溶血性弧菌的热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列设计引物,建立多重PCR检测方法,相应扩增片段依次为564bp、617bp、471bp和202bp.用该方法检测EVC、CVC、副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、沙门氏菌等35株菌株表现出极好的特异性,对人工污染的罗非鱼、小虾、牡蛎、鱼鳃和鱼肠混合物的检出限EVC为2.2 cfu/mL、CVC为2.8 cfu/mL、副溶血性弧菌为6.5 cfu/mL,扩增片段表现出极好的特异性,整个实验过程8～10h完成.实验结果表明该方法是特异性强、省时、省力的检测方法.     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

设计合成2对PCV型特异性引物,其中C1、C2扩增PCV1和PCV2共有的938bp特异性片段,C3、C4只扩增PCV2特异性的490bp片段.在对该多重PCR的反应条件进行优化后,建立了猪圆环病毒多重PCR诊断方法,既可对PCV进行定性检测,又可对PCV1和PCV2进行定型,便于口岸检疫和养殖场的临床诊断.     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。     

嗜肺军团菌血清1型荧光PCR检测方法的研究

本研究利用嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因,设计并筛选出一对实时荧光PCR引物和Taq Man探针,建立了嗜肺军团菌血清1型(Lp1)实时荧光PCR检测方法。特异性试验显示,3株Lp1出现了典型的扩增曲线,23株近源参考菌株没有扩增。灵敏度试验显示,水中Lp1的检测底线可达到1.1×10² CFU/mL。重复性试验结果显示,高、中、低浓度扩增Ct值相对标准偏差分别为0.51%、0.42%、0.31%。结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、重复性好、检测流程短,适于水环境污染状况调查及应急事件快速检测。     

瑞芬太尼复合小剂量咪达唑仑监护性麻醉用于内镜逆行胰胆管造影术效果观察

目的观察瑞芬太尼复合小剂量咪达唑仑用于内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)监护性麻醉的临床效果及安全性。方法选择102例在监护性麻醉下行ERCP的患者,按麻醉方法不同分为单纯瑞芬太尼组(R组)和瑞芬太尼复合小剂量咪达唑仑组(RM组),每组51例,观察两组不同时点,包括麻醉前(T0)、ERCP手术开始(T1)、手术开始后5分钟(T2)、手术开始后10分钟(T3)和术毕(T4)的平均动脉压(MAP)、心率(HR)、血氧饱和度(Sp O2)和脑电双频指数(BIS),并记录手术操作时间、麻醉时间及不良事件。结果 RM组MAP在T1~T3时与T0比较无明显变化,T4时升高;HR在T2开始持续加快;Sp O2在T2开始降低,T3时又有所升高;BIS T1时开始降低,之后保持平稳。组间比较,RM组的MAP在T1~T3时明显低于R组,HR在T1、T2时明显低于R组,Sp O2在T2之后明显低于R组,BIS在T1~T3时明显低于R组,以上差异均有统计学意义;其他时间比较差异无统计学意义。结论 ERCP操作中采取瑞芬太尼复合咪达唑仑麻醉,与单纯使用瑞芬太尼相比,血流动力学变化更加平稳,但对患者呼吸系统影响较大,易发生气道意外,因此,临床上应谨慎选择麻醉方法。     

牛朊病毒正常蛋白特异性片段的克隆表达和纯化

[目的] 表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段.[方法] 用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达产物(包涵体)用8mol/L尿素溶解,在变性条件下用Cu2+氧化复性纯化.[结果] 重组表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,目的蛋白分子量约为15KD,Western blotting分析表明,目的蛋白具有朊病毒蛋白的抗原特性,变性条件下用Cu2+氧化复性纯化得到电泳纯的重组蛋白.[结论] 这一工作为下一步制备抗体和进行结构、功能的研究打下扎实基础.     

产志贺毒素大肠杆菌的分子生物学检测方法研究

[目的]建立快速准确检测食品中产志贺毒素大肠杆菌的分子生物学方法.[方法]针对产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因,设计了4对特异性引物.[结果]采用多重PCR(multiplexPCR)方法,得到614bp、779bp、450bp和300bp 4条片断.[结论]实验结果表明,本文建立的mPCR方法较常规的大肠杆菌检测方法简便、快速、灵敏度高,灵敏度可达15cfu/mL.     

鸡新城疫病毒强弱毒株RT—PCR鉴别诊断方法

本研究通过对不同毒力的新城疫病毒(NDV)的融合蛋白基因(F基因)核苷酸序列分析,根据毒力和序列间的相关规律,分别设计出3对引物P1+P2,P1+P3,P1+P4,建立了一种可以迅速鉴定新城疫病毒并且同时鉴别毒株毒力强弱的RT-PCR方法.引物P1+P2能特异性地对所有新城疫病毒可扩增出一条362bp的片段,引物P1+P3能特异性地针对所有新城疫强毒株扩增出一条254bp的片段,引物P1+P4能特异性地针对所有新城疫弱毒株扩增出一条254bp的片段,整个试验过程可在6小时内完成.对实验室分离的4株病毒进行检测,结果同常规检测方法的结果一致.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

结核菌快速检测方法用于口岸检疫的研究

[目的]评价两种结核菌快速检测方法在口岸卫生检疫中的应用价值。[方法]以＂中华人民共和国行业标准-肺结核诊断标准WS288-2008＂选取结核病人100例,有呼吸道症状的疑似病人50例,以罗氏L-J固体培养结果为标准,考核荧光实时定量PCR（RT-PCR）、分枝杆菌直接检测（MDT）在结核病诊断的敏感性、特异性。[结果]100例结核病人标本培养后均为阳性,50例可疑者标本培养后均为阴性;100例培养阳性的标本,荧光实时定量PCR检测出98例阳性,MDT检测出100例阳性;50例培养阴性标本,荧光实时定量PCR检测出1例阳性,MDT未检测阳性。RT-PCR的敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值为98.04%、98.04%、99.01%、96.15%;MTD检测敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值均为100%。[结论]与传统培养方法相比较,两种方法有着很高的敏感性和特异性,但检测时间大大缩短,适合应用于口岸卫生检疫中。     

公仆型领导:概念的界定与量表的修订

采用一组管理者-员工配对样本数据和一组管理者样本数据对西方的公仆型领导的结构与含义进行了深入分析并对量表的效度进行了验证.探索性因素分析(N=285)表明,公仆型领导由利他主义、情绪抚慰、智慧、说服引导和社会责任感五个维度构成.验证性因素分析(N=304)表明,五维度的结构模型对数据拟合最佳.为了更好地考察公仆型领导量表的结构效度和实证效度,采用"管理者-员工"配对样本(N=209)数据进行分析,结果表明,公仆型领导量表具有较高的结构效度和实证效度.     

月经失调运动员的内分泌特点

目的:通过研究广东省体育运动技术学院73名月经失调运动员的内分泌特点,探讨长期运动训练对女运动员内分泌的影响,预防运动性月经失调的发生.方法:对运动员月经情况进行整群抽样调查,根据月经周期失调的不同情况分为闭经组、长周期组、短周期组、对照组.测定各组运动员的卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(HL)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)、皮质醇(C).结果:闭经组与长周期组促性腺激素、性激素血清浓度水平相近;短周期组与对照组的FSH、LH血清浓度比较具有显著性差异(p＜0.05);短周期组与对照组的E2血清浓度比较具有显著性差异(p＜0.01);闭经组与对照组的T血清浓度比较具有较显著性差异(p＜0.01),长周期组与对照组具有显著性差异(p＜0.05);闭经组、长周期组与对照组的C血清浓度比较具有显著性差异(p＜0.05),短周期组与对照组比较具有显著性差异(p＜0.01);结论:月经失调运动员促性腺激素与性激素的血清水平下降基本同步,闭经运动员的情况较严重,月经周期延长的运动员很有可能发展为闭经,短周期组性腺轴的调控功能较差.     

甲状腺全切术与次全切术治疗分化型甲状腺癌效果对比

目的对比甲状腺全切术(TT)与甲状腺次全切术(ST)治疗分化型甲状腺癌(DTC)的疗效。方法选取98例符合纳入标准的DTC患者按手术术式不同分为TT组44例和ST组54例,观察比较两组患者手术状况、术后并发症及术后1年复发率。结果与ST组相比,TT组术中出血量明显减少,手术时间显著缩短,而住院时间组间比较差异无统计学意义。TT组低血钙症发生率显著高于ST组,而甲状旁腺损伤、喉返神经损伤和喉上神经损伤发生率组间比较差异无统计学意义。随访1年,两组复发率比较差异无统计学意义。结论 TT与ST手术治疗DTC各有利弊,临床上应根据患者实际情况合理选择。     

用FQ-PCR方法快速检测水产品中副溶血弧菌

[目的]采用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测与鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量检测试剂盒.[方法]根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线.以副溶血弧菌菌株8株及同源及非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测.同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测.[结果]该方法有良好的特异性8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其他24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,其它15株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.9871.直接进行定量检测,则检测低限在102cfu/g;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfu/g.[结论]该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景.     

克罗诺阪崎肠杆菌微滴数字PCR定量方法的建立

为建立克罗诺阪崎肠杆菌的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)快速定量检测方法,针对克罗诺阪崎肠杆菌的特异性单拷贝PapC基因设计引物探针,进行特异性、灵敏度和重复性实验,本文通过对纯菌液进行检测,比较平板计数法、实时PCR和ddPCR...     

牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

[目的]建立牛传染性鼻气管炎的PCR检测方法.[方法]根据牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化.[结果]得到与预期大小(362bp)一致的特异性片段.最佳退火温度为58～64℃,Mg2+最佳浓度为1.6mM,dNTPs为0.36mM,引物为0.2 pmol/μL,聚合酶0.8U/100μL.用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带.[结论]该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100μL,较其他方法敏感.     

祈使语气广告语对购买意愿的影响机制研究

本文在祈使语气广告语对消费者购买意愿的影响研究基础上,引入品牌熟悉性和产品类型两个调节变量。2×2×2组间实验表明:(1)品牌熟悉性和产品类型都发挥调节作用;(2)对高品牌熟悉度产品来说,祈使语气广告语对购买意愿的影响大于非祈使语气广告语的影响,享乐型和功能型产品都是如此;对低品牌熟悉度产品来说,功能型产品使用非祈使语气广告语对购买意愿的影响大于祈使语气广告语的影响,享乐型产品情况刚好相反。     

食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR检测方法研究

利用沙门氏菌fim Y基因设计特异性引物、探针,优化叠氮溴化丙锭(propidium azide bromide,PMA)染料浓度及相关反应条件,使用高亮度蓝色发光二极管(Light Emitting Diode,LED)光解仪代替卤素光源,建立了食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR快速检测方法。实验表明,设计的引物、探针特异性强,能特异性扩增7株沙门氏菌,其他非沙门氏菌均无扩增,对沙门氏菌纯培养物检测灵敏度可达10² CFU/m L。经反应条件优化后,在PMA浓度为20μmol/L,暗反应5 min,曝光反应10 min条件下,对10⁶ CFU/m L的沙门氏菌热致死菌抑制效果最好,活菌的扩增不受影响。利用优化的PMA处理方法结合Taq Man实时荧光PCR和不经PMA处理的Taq Man实时荧光PCR,分别检测3种不同浓度(5 CFU/25 g、50 CFU/25 g、500 CFU/25 g)活菌和高浓度死菌(10⁶ CFU/25 g)的沙门氏菌人工混合污染样品,以及仅高浓度沙门氏菌死菌污染的人工污染样...