荧光RT—PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液,并同时与鸡胚病毒分离比较表明,荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,最低为10-5,略低于鸡胚病毒分离.对23株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出,本课题建立的荧光RT-PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒.用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒,未发现交叉反应.     

荧光RT—PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用6株新城疫病毒分离株人工感染28日龄肉鸡,感染后3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子,对死亡鸡进行病理剖检,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等,制备组织脏器悬液,作倍比稀释,用建立的荧光RT-PCR方法检测并同鸡胚分离比较.试验表明,荧光RT-PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致,荧光RT-PCR检测脏器的最低检测量为5X10-5,肌肉的最低检测量为5X10-3,拭子的最低检测量为10-3.用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT-PCR表明,裂解液处理样品方法优越,可提高检测灵敏度.     

鸡新城疫病毒强弱毒株RT—PCR鉴别诊断方法

本研究通过对不同毒力的新城疫病毒(NDV)的融合蛋白基因(F基因)核苷酸序列分析,根据毒力和序列间的相关规律,分别设计出3对引物P1+P2,P1+P3,P1+P4,建立了一种可以迅速鉴定新城疫病毒并且同时鉴别毒株毒力强弱的RT-PCR方法.引物P1+P2能特异性地对所有新城疫病毒可扩增出一条362bp的片段,引物P1+P3能特异性地针对所有新城疫强毒株扩增出一条254bp的片段,引物P1+P4能特异性地针对所有新城疫弱毒株扩增出一条254bp的片段,整个试验过程可在6小时内完成.对实验室分离的4株病毒进行检测,结果同常规检测方法的结果一致.     

荧光RT—PCR在临床检测的应用

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒的方法检测了5批临床样品,其中有禽肉、鸡咽喉拭子/泄殖腔拭子、鸽泄殖腔拭子,其中检出3份样品中有中强毒力新城疫病毒,用鸡胚分离方法并经毒力鉴定证实了检测结果的准确性.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT—PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中.本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT-PCR检测的方法.     

昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT—PCR检测方法的建立

[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7．0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限：昆津病毒1．83106copies／μL,巴马哈森林病毒2．02×106copies／μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。     

应用RT—PCR检测灭活疫苗中口蹄疫病毒（核酸）

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测口蹄疫灭活疫苗中的病毒RNA.设计相应于病毒基因组VP1序列保守区段20mer长度的引物.分离出灭活疫苗水相,萃取总RNA,反转录合成cDNA,进行PCR扩增和电泳检测扩增产物,本引物对扩增片段长度483bp,并设计一个Marker作为对照.     

应用荧光RT—PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

猪流行性腹泻病毒套式RT—PCR检测方法的建立及初步应用

[目的] 建立PEDV的新型套式RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段.[方法] 根据Genbank已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的基因序列,设计合成两对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测PEDV的新型套式RT-PCR方法,并用该方法对PEDV进行了快速诊断和分析.[结果] 外引物扩增目的片段长度为1328bp,内引物扩增目的片段为540bp.[结论] 该套式RT-PCR方法比普通RT-PCR更加灵敏、可靠,可用于PEDV的快速诊断和流行病学调查.     

检测猪传染性胃肠炎病毒RT—PCR方法的建立

[目的]建立对猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学调查提供可靠的和敏感的手段.[方法]根据Genbank收录的TGEV-Miller毒株S蛋白的基因序列,设计合成一对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.[结果]两条引物扩增目的片段长度为1262bp.经测序分析,与Miller毒株的同源性为99.1%.[结论]该RT-PCR方法灵敏,可靠,具有很强的临床检测意义,可用于TGEV的快速诊断和流行病学调查.     

三种禽用疫苗外源病原多重荧光PCR检测方法建立

根据GenBank中收录的鸡毒支原体、禽白血病病毒和网状内皮细胞增生症病毒的基因序列,分别设计并合成了引物和相应的荧光探针,通过对反应条件和反应程序的优化,建立了一种可以同时检测3种禽用疫苗外源性病原污染因子的三重荧光PCR检测方法。结果显示,建立的三重荧光PCR灵敏度高,最低可检测到10 copies/μL的质粒,并具有良好的特异性,可用于禽用疫苗外源性污染因子的快速检测,也可用于相关疫病的诊断。     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。