PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

3种ELISA试剂盒对牛新孢子虫血清抗体比较检测

用瑞典Svanova公司、美国IDEXX公司和美国VMRD公司生产的3种检测新孢子虫血清抗体ELISA试剂盒对来自澳大利亚牛血清（41份）、新西兰牛血清（40份）、乌拉圭牛血清（30份）和中国新疆牛血清（46份）进行了同步检测和比较分析,并以其中2个试剂盒检测结果均为阳性或阴性的血清为真阳性或真阴性,对另1个试剂盒在诊断相对敏感性和相对特异性方面进行了比较评估。结果表明,3个试剂盒的诊断相对敏感性和诊断相对特异性分别为：85.7%和92.5%（Svanova）、95.8%和98%（IDEXX）、88.5%和98%（VMRD）。3个试剂盒都具有较好的重复性,检测低限相近。在对样品的检测中,IDEXX与VMRD两个试剂盒检测符合率较高,但对不同国家的样品检测符合率差别较大。     

病毒分离结合荧光抗体技术与抗原捕获ELISA检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原的敏感性比较研究

本研究通过体外增毒,再测定病毒的TCID50,然后将病毒培养物作系列稀释,比较了细胞传两代进行荧光抗体染色法与三种商品化的抗原捕获ELISA试剂盒(包括IDEXX公司生产的BVDV抗原检测试剂盒、POURQUIER生产的P80检测试剂盒及NSP2-3/E0检测试剂盒)检测病毒抗原的敏感性.结果表明,传两代进行荧光抗体染色的方法可检出10-6稀释的50μL细胞毒(0.12个TCID50),而三种商品化进口ELISA试剂盒分别只能达到10-2 (1.2×103个TCID50)和10-1 (1.2×104个TCID50)稀释的50μL细胞毒.尽管传两代进行荧光抗体染色的方法相对繁琐,但这种方法的敏感性是抗原捕获ELISA难以比拟的,因而更适合于血清中BVDV病毒抗原的检测.     

快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断西尼罗病毒感染的胶体金免疫层析试纸条方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记西尼罗病毒NS1蛋白,采用双抗原夹心法制备胶体金免疫层析试纸条,对试纸条进行特异性和敏感性评价。[结果]该试纸条可在15min之内完成检测;在敏感性上,该试纸条对阳性血清的检测较美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒检测低1个滴度;对89份阴性血清进行检测,试纸条检出9份阳性,ELISA试剂盒检出3份阳性,两种检测的符合率为86.52%,特异性为89.89%。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测西尼罗病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。     

性传播疾病中梅毒血清学检测方法分析

[目的]探讨性传播疾病患者梅毒螺旋体特异性抗体血清学实验诊断方法，为临床诊断提供参考依据。[方法]用酶联免疫法（ELISA）和梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）检测89例梅毒阳性患者，同期选择健康体检114例作酶联免疫吸附实验阴性对照。[结果]两种检测方法无显著性差异，有良好一致性，酶联免疫法操作简单，具有高度敏感性和特异性，且酶标记试剂比较稳定和价廉，是目前梅毒血清学试验首选方法。     

磺胺类药物的多残留酶联免疫法检测

本研究通过制备针对多种磺胺类药物具有敏感性的多克隆抗体(抗血清),建立快速ELISA检测方法,并初步应用于动物样品中药物残留的检测.以H1-HSA免疫动物获得的抗血清对磺胺药表现了较高的敏感性,且能识别氨苯磺胺及7种常用的磺胺药,其中的5种检测限低于最高残留限量100ng/mL;抗体与4种常用抗生素和3种结构类似物无交叉反应,具有较好的特异性;牛奶基质中药物的检测限均低于80ng/mL,鸡肌肉、肝脏样品中SMD的检测限均低于85ng/mL,基本上能满足磺胺类药物多残留免疫检测的要求.     

一例梅毒合并疱疹青春期患者的调查

通过对我院一例梅毒合并疱疹感染的青春期患者梅毒血清学漏诊案例调查分析,了解梅毒血清学试验在诊断青春期女性梅毒感染中的检测性能.将患者初次就诊时采取的血样分别使用ELISA、CLIA、RT、WB、TPPA及RPR进行梅毒特异性抗体和非特疫性抗体检测.ELISA有1个试剂厂家检测出阳性,2个试剂厂家未能检测出阳性;CLIA...     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M基因核苷酸序列设计一对特异性引物,扩增位置在M基因的14744～14846位,片段长度为103bp。提取PRRS RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测PRRSV的方法。并用该方法检测送检的临床疑似病料,结果表明,本研究建立的PRRSV-SYBR Green I PCR特异性强,操作简单,耗时短,只需3h即可完成整个实验过程,可初步用于临床检测。     

PRRS检测技术的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状及死亡为主要特征的一种高度接触性传染病。及时发现、准确检测对本病的防治和彻底根除有重要意义,除病毒分离、鉴定的经典方法外,随着分子生物学的发展,对该病的检测已深入到分子水平,本文针对各种检测技术研究进展做一综述。     

猪伪狂犬病抗体免疫金标快速检测试纸法的建立和应用

应用免疫学原理与胶体金层析技术相结合,采用双抗原夹心法建立了检测猪伪狂犬病抗体水平的"猪伪狂犬病抗体免疫胶体金标快速检测试纸法",该法与美国Idexx公司的猪伪狂犬病ELISA试剂盒同时对16份猪血液或血清进行抗体水平检测,符合率达100%.同时对100份猪血液和对应血清进行检测,结果也相同.试验结果显示,本法与ELISA一样,具有微量、特异、准确等优点,且操作简易,而本方法不需要任何仪器,检测时间短,结果直观,容易判定,适用于基层兽医站、养猪场使用和大面积猪伪狂犬病抗体普查.     

盐酸克伦特罗胶体金快速检测试剂盒质量研究

选取3种市售同批次盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测试剂盒(D、M、A),引入金标读数仪,对其最小检出浓度、灵敏度、特异性、检出限、阳性检出率、假阳性率和假阴性率等方面进行研究,比较3种市售盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测试剂盒的质量。结果表明,D试剂盒中的检测卡在检测盐酸克伦特罗标准溶液时产品性能最优,M试剂盒的样品前处理方法和检测卡在猪肉基质中的综合使用效果最优。阴性猪肉加标样本的快速检测结果显示,试剂盒检测结果与金标读数仪器检测结果 100%符合,3种产品的最小检出浓度均小于产品说明书标注的检出限,且灵敏度100%,D、M特异性100%,D、M假阳性率0%,M阳性检出率100%,D、A阳性检出率均大于90%。综合分析,3种试剂盒的准确性、特异性等均较好,阳性检出率、假阴性率均在可接受范围内,其中,M试剂盒产品性能最优,可用于日常生猪屠宰点和农贸市场中猪肉盐酸克伦特罗的初筛。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种较新的严重危害养猪业的病原。主要导致呼吸障碍,怀孕母猪繁殖障碍和新生仔猪死亡等症状。本文就PRRSV基因组结构与功能,主要结构蛋白,PRRSV基因组的变异和抗原性变异等三方面的研究进展做一综述。     

四种大肠菌群快速检测纸片质量考察

为了探讨不同温度与时间对大肠菌群检测纸片的影响,本文利用目标菌对市场上常见的4种大肠菌群检测纸片的特异性、敏感性、抗干扰性以及采样后稳定性进行相关质量测试。测试发现,当挑战菌浓度在5～10 CFU·mL~(-1)时,所选4种纸片的特异性、敏感性和抗干扰性一致,采样后冷藏保存时间≤12 h、室温保存时间≤4 h,4种纸片回收率在37%～71%。     

磺胺-5-甲氧嘧啶酶联免疫分析试剂盒的研制与应用

[目的]建立动物食品中残留磺胺-5-甲嘧啶的检测方法.[方法]用戊二醛法将磺胺-5-甲嘧啶(SMD)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白OVA)偶联.用紫外分光光度计进行扫描鉴定.以制备的SMD-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与骨髓细胞(SP2/0-Ag14)融合,制备腹水,获得高效价的抗体.[结果]建立了间接竞争ELISA的测定方法,检测限为1.766ng/mL,定量限为11.274ng/mL.用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原,做ELISA实验,结果显示抗体与这8种磺胺药没有交叉反应.制备了检测试剂盒,在肌肉、肝脏的样本中加入50ng/mL,100ng/mL做添加回收实验,回收率为87.45%～97.6%,变异系数为3.35%.[结论]本方法的检测限能够满足动物源性食品中SMD残留检测的要求,试剂盒灵敏度高,稳定性好,使用方便,适于基层大规模筛选.     

磺胺-5-甲氧嘧啶酶联免疫分析试剂盒的研制与应用

[目的]建立动物食品中残留磺胺-5-甲嘧啶的检测方法.[方法]用戊二醛法将磺胺-5-甲嘧啶(SMD)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白OVA)偶联.用紫外分光光度计进行扫描鉴定.以制备的SMD-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与骨髓细胞(SP2/0-Ag14)融合,制备腹水,获得高效价的抗体.[结果]建立了间接竞争ELISA的测定方法,检测限为1.766ng/mL,定量限为11.274ng/mL.用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原,做ELISA实验,结果显示抗体与这8种磺胺药没有交叉反应.制备了检测试剂盒,在肌肉、肝脏的样本中加入50ng/mL,100ng/mL做添加回收实验,回收率为87.45%～97.6%,变异系数为3.35%.[结论]本方法的检测限能够满足动物源性食品中SMD残留检测的要求,试剂盒灵敏度高,稳定性好,使用方便,适于基层大规模筛选.     

结核菌快速检测方法用于口岸检疫的研究

[目的]评价两种结核菌快速检测方法在口岸卫生检疫中的应用价值。[方法]以＂中华人民共和国行业标准-肺结核诊断标准WS288-2008＂选取结核病人100例,有呼吸道症状的疑似病人50例,以罗氏L-J固体培养结果为标准,考核荧光实时定量PCR（RT-PCR）、分枝杆菌直接检测（MDT）在结核病诊断的敏感性、特异性。[结果]100例结核病人标本培养后均为阳性,50例可疑者标本培养后均为阴性;100例培养阳性的标本,荧光实时定量PCR检测出98例阳性,MDT检测出100例阳性;50例培养阴性标本,荧光实时定量PCR检测出1例阳性,MDT未检测阳性。RT-PCR的敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值为98.04%、98.04%、99.01%、96.15%;MTD检测敏感性、特异性、阳性预期值、阴性预期值均为100%。[结论]与传统培养方法相比较,两种方法有着很高的敏感性和特异性,但检测时间大大缩短,适合应用于口岸卫生检疫中。     

建立及应用高通量液相芯片方法检测鉴别四种动物源性成分

根据GenBank中反刍动物、禽、猪和鱼线粒体DNA序列,分别设计特异性引物和探针,建立同时检测反刍动物、禽、鱼三大类物种和猪成分的四重液相芯片方法,并对其特异性、敏感性和重复试验稳定性进行验证评估.结果 显示该方法能够准确检出鉴别4种目标物种,与非目标物种无交叉反应;对DNA模板检测低限可达到0.01～0.05 ng...     

盐酸克仑特罗检测试剂盒的研制

本研究通过将盐酸克仑特罗分别与自制血清白蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶联后,制成免疫原和包被抗原,利用单克隆抗体制备技术,制备了能够分泌抗盐酸克仑特罗的单克隆抗体细胞株.以自制血清白蛋白效价最好,且该株细胞分泌的抗体特异性强,与其它克仑特罗类药物无交叉反应.在筛选出盐酸克仑特罗单克隆抗体的基础上,首次研制出利用单克隆抗体对动物组织中残留的盐酸克仑特罗进行检测的试剂盒.本试剂盒的最低检测限为0.1ng/mL,检测范围为0.1-10ng/mL,通过对24份阳性样品检测并与德国r-biopharm公司和英国的RANDOX公司同类试剂盒作对比试验,阳性符合率95.8%.     

岩沙海葵毒素直接酶联免疫吸附检测方法的研究

[目的]制备岩沙海葵毒素(PTX)多抗血清,纯化并标记辣根过氧化物酶,建立PTX多克隆直接酶联免疫吸附检测方法.[方法]将纯品毒素PTX与大分子蛋白质匙眼血蓝蛋白(KLH)分别巯基化,用化学法偶联二者成为半抗原,以其诱导BALB/c小鼠产生多价抗血清;以辣根过氧化物酶(HRP)标记PTX多抗血清;以PTX纯毒素作为包被抗原,HRP标记的多价抗血清为酶标抗体,建立PTX多抗直接ELISA检测方法.[结果]制备的抗PTX多价抗血清,经纯化后与HRP标记成功;建立的PTX多抗直接ELISA检测法,其最佳工作浓度为180.[结论]本研究制备的PTX人工免疫抗原具有较高的特异性和免疫原性,多克隆抗体为特异性抗PTX抗体,PTX多抗直接ELISA检测法对PTX的检测可达到5～10ug水平,该法应用于海产品中PTX快速检测的结果,待进一步研究.     

定量检测SARS-CoV N蛋白的悬浮芯片方法研究

利用悬浮芯片技术,建立定量检测SARS-CoV N蛋白的悬浮芯片方法。用抗体包被编码微球作为反应载体,双抗体夹心法为反应模式,建立了SARS冠状病毒悬浮芯片检测方法,通过盲样和实验室标准检测等评估,表明适用于现场样品的检测。检测SARS冠状病毒N蛋白的灵敏度为4.86 ng/mL,在4.86-25600 ng/mL浓度范围内具有良好的动力学响应特性,比ELISA方法有较高的灵敏度和较宽动态检测范围。在早期识别、快速诊断和应对生物恐怖威胁、传染病暴发中具有广阔的应用前景。