应用荧光RT—PCR方法定性检测H5亚型禽流感病毒

在活禽及其产品国际贸易中,缩短对AIV的检测时间,有利于其快速通关.荧光RT-PCR是最近发展和应用的一种新的检测技术.北京出入境检验检疫局与深圳匹基生物工程公司共同研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒,并起草了中华人民共和国国家标准(GB/T 19438.2-2004).本实验室参照该方法对送检的多份样品进行禽流感病毒检测,整个试验过程不到4h,与传统方法比较大大缩短了检测时间,值得在检验检疫系统广泛应用.     

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性.表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒.但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性.推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的正向基因芯片的制备

通过分析比较禽流感病毒H5、H7和H9亚型不同毒株的基因组序列,设计出H5、H7和H9亚型特异性引物与探针,将扩增产物点制在芯片上,分别用H5、H7和H9亚型特异性探针与芯片杂交,研制出用于禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测的正向杂交基因芯片,同时对正向基因芯片进行特异性、敏感性试验,并用该方法对待检样品进行了检测。结果表明,禽流感病毒正向基因芯片与新城疫病毒、传支病毒等6种禽类常见病毒无反应,其敏感性高于常规PCR方法。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因克隆及分子进化分析

用RT-PCR方法,以1株H2N2亚型禽流感病毒分离株RNA为模板,扩增了HA全基因cDNA.将HAcDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行了测序.测序结果表明所克隆的1685bp核苷酸片段包含了全部HA基因阅读框架和上下游引物,编码区为1683个核苷酸,编码560个氨基酸.将其序列与其他8株H9N2亚型禽流感病毒HA基因及推导的氨基酸序列进行比较,其核苷酸同源性在85.3%～98.6%之间,氨基酸同源性在88.8%～98.9%之间,HA基因裂解位点氨基酸序列没有连续碱性氨基酸插入.本研究结果为国内基因工程疫苗等研究奠定了基础,同时通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系.     

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.     

五种血清型柯萨奇病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

在柯萨奇病毒基因组VP1区设计引物和探针,分别建立了特异性检测5种血清型（A9、A16、B2、B3和B5型）柯萨奇病毒（Coxsackievirus）基于MGB探针的实时荧光RT-PCR方法。通过构建的分别适于5种血清型病毒检测的质粒标准分子对建立的检测体系进行了灵敏度分析,确定5种血清型柯萨奇病毒检测体系的检测下限均为2拷贝质粒标准分子DNA。     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

贝类产品中诺沃克病毒RT-PCR检测方法

本文建立了贝类产品中诺沃克病毒检测的普通RT-PCR方法.用8对引物对诺沃克病毒进行检测研究,发现GII-SKF/GII-SKR引物检测GII型病毒特异性强且灵敏度高.用引物GI-SKF/GI-SKR和GII-SKF/GII-SKR分别对系列稀释度的质粒进行检测,检测灵敏度均能达到102拷贝.将诺沃克病毒添加于牡蛎肠胃组织中并提取RNA,并用引物GI-SKF/GI-SKR 和GII-SKF/GII-SKR对其进行扩增,检出GII型诺沃克病毒.     

荧光RT—PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用6株新城疫病毒分离株人工感染28日龄肉鸡,感染后3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子,对死亡鸡进行病理剖检,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等,制备组织脏器悬液,作倍比稀释,用建立的荧光RT-PCR方法检测并同鸡胚分离比较.试验表明,荧光RT-PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致,荧光RT-PCR检测脏器的最低检测量为5X10-5,肌肉的最低检测量为5X10-3,拭子的最低检测量为10-3.用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT-PCR表明,裂解液处理样品方法优越,可提高检测灵敏度.     

荧光RT—PCR在临床检测的应用

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒的方法检测了5批临床样品,其中有禽肉、鸡咽喉拭子/泄殖腔拭子、鸽泄殖腔拭子,其中检出3份样品中有中强毒力新城疫病毒,用鸡胚分离方法并经毒力鉴定证实了检测结果的准确性.     

用RT-PCR快速检测Taura综合症病毒

用RT-PCR快速检测南美白对虾中的Taura综合症病毒.引物TSVF和TSVR用于扩增病毒核酸中的231bp的片段.该方法能可靠地检测到患病的南美白对虾体内的Taura综合症病毒.     

荧光RT—PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液,并同时与鸡胚病毒分离比较表明,荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,最低为10-5,略低于鸡胚病毒分离.对23株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出,本课题建立的荧光RT-PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒.用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒,未发现交叉反应.     

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT—PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中.本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT-PCR检测的方法.     

荷兰进口百合斑驳病毒的分子检测

荷兰进口百合种球,经过隔离试种,采用RT-PCR方法对怀疑感染有百合斑驳病毒的百合植株进行病毒检测,通过对RT-PCR检测扩增到的产物进行克隆测序,分析其序列,并与其他6个已知斑驳毒株进行比较,其同源性达到99%,通过汁液摩擦接种健康植株,3～7天后表现出斑驳症状,确认荷兰进口百合种球携带有百合斑驳病毒(Lily Mottle Virus(LMoV)).     

利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒

根据百合无症病毒(LSV)的核苷酸序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增得到了一条与目的片段大小一致的条带;进一步克隆测序表明,该序列与已知的LSV序列有96%的同源性.用随机引物法合成地高辛标记的cDNA探针,建立了核酸斑点杂交检测体系.本研究分别建立了用于LSV的特异性的高灵敏度RT-PCR检测体系(其检测灵敏度为1.4ng/叶片)和适合大通量检测的Dig-cDNA(地高辛标记)核酸斑点杂交检测体系(其检测灵敏度为20μg/叶片).     

中强毒力新城疫病毒（NDV）荧光RT—PCR检测方法建立及体系优化

根据新城疫病毒F基因序列,选择能够反应裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针,从中筛选出最佳引物、探针配对,对引物、探针的浓度、Taq酶用量、逆转录酶、循环数、逆转录反应体积、样品RNA提取方法等进行了优化,建立了快速检测中强毒力新城疫病毒的方法-荧光RT-PCR.