应用RT—PCR检测灭活疫苗中口蹄疫病毒（核酸）

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测口蹄疫灭活疫苗中的病毒RNA.设计相应于病毒基因组VP1序列保守区段20mer长度的引物.分离出灭活疫苗水相,萃取总RNA,反转录合成cDNA,进行PCR扩增和电泳检测扩增产物,本引物对扩增片段长度483bp,并设计一个Marker作为对照.     

微卫星标记位点的分离及其在美洲剑线虫群体分类鉴定上的应用

在美洲剑线虫群体(Xiphinema americanum group)上,应用简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应(DOPPCR)技术,克服了基因组DNA样本不足的难题,成功在微量基因组DNA条件下分离和标记了微卫星重复子(Microsatellite).研究中,目标DNA片段被克隆前,DOP-PCR产物首先被连接到载体上,然后通过寡核苷酸(CA)9和载体上游引物,对包含微卫星位点的左侧DNA片段进行PCR扩增,该过程后的产物用于克隆和DNA序列分析;依据已分析的部分左侧序列,设计引物并与载体下游引物一起,对DOP-PCR产物再进行PCR扩增,使包含整个微卫星及其右侧连接部分被扩增,重复克隆和DNA序列分析并结合已分析的左侧序列,获得了包含全部微卫星重复子的DNA片段的完整序列.这种分离含微卫星标记位点DNA片段的路径新颖、高效,有效克隆率提高到了93.3%.研究中,发现和分析了9个包含微卫星重复子的片段,美洲剑线虫(X.americanum sensu stricto)和美洲剑线虫亚群组(X.americanum subgroup)的标记性引物被设计和检测.     

粉丝中植物源性成分的PCR定性检测方法研究

本研究针对绿豆、豌豆、玉米、红薯与马铃薯这5个物种的特异基因序列,设计出多对引物,并分别从每个物种中选择特异与扩增效率最好的一对引物进行实验.通过特异性实验、重复性实验及灵敏性实验后,最终获得5对引物,即绿豆引物MP4、豌豆引物PEP2、玉米引物CP1、红薯引物SP2、马铃薯引物POP2.采用这5对引物进行PCR扩增,就可以检测出粉丝中这5种植物源性成分.本方法准确、灵敏、快速,检测的灵敏度达5%.     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯黑环斑病毒的研究

马铃薯黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）是马铃薯重要病毒病害之一。本研究根据PBRSV基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）保守序列,设计合成了两对巢式PCR引物和1条Taq-MAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Realtime PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM试剂盒快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达450fg/μL植物总RNA。利用4对引物和1条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Yvein necrosis strain,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本研究根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP）基因序列保守区域,设计合成了两对巢式PCR引物和一条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Real-time PCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Real time PCR等方法高。该方法检测灵敏度可达3 fg/μL植物总RNA。利用四对引物和一条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,检测的准确性比其它方法高。     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

目的:弗尼斯弧菌(Vibrio fumissii)是引起世界范围内胃肠功能紊乱的致病菌之一,一般通过摄人生的或者未煮熟的水产品进行传播。本研究旨在建立高效、可靠的PCR检测方法应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。方法和结果:根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计普通PCR引物及实时PCR引物、探针,建立普通PCR和实时荧光PCR方法,分别对两种方法的特异性和灵敏度进行比较分析,同时应用于384份食品样品检测。结果表明,建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为:2.4×10^3 CFU/ml和24 CFU/ml,并于5 h内完成整个检测过程,同时对384份食品进行检测,共检出6株阳性菌株。结论:本研究建立的PCR检测技术灵敏度高、特异性好,可应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

[目的]建立牛传染性鼻气管炎的PCR检测方法.[方法]根据牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化.[结果]得到与预期大小(362bp)一致的特异性片段.最佳退火温度为58～64℃,Mg2+最佳浓度为1.6mM,dNTPs为0.36mM,引物为0.2 pmol/μL,聚合酶0.8U/100μL.用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带.[结论]该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100μL,较其他方法敏感.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR鉴定简单异尖线虫方法的建立

根据GenBank发表的简单异尖线虫保守的ITS-2基因序列设计一对引物,用以扩增简单异尖线虫114 bp基因片段。用简单异尖线虫的重组质粒（AS-ITS-pGM）为模板建立SYBR Green I荧光定量PCR检测简单异尖线虫的方法,并用该方法对经PCR-RFLP鉴定为简单异尖线虫的样品进行鉴定。结果表明,本研究建立的简单异尖线虫SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,稳定性好,可用于简单异尖线虫的鉴定。     

利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒

根据百合无症病毒(LSV)的核苷酸序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增得到了一条与目的片段大小一致的条带;进一步克隆测序表明,该序列与已知的LSV序列有96%的同源性.用随机引物法合成地高辛标记的cDNA探针,建立了核酸斑点杂交检测体系.本研究分别建立了用于LSV的特异性的高灵敏度RT-PCR检测体系(其检测灵敏度为1.4ng/叶片)和适合大通量检测的Dig-cDNA(地高辛标记)核酸斑点杂交检测体系(其检测灵敏度为20μg/叶片).     

一步法实时荧光RT-PCR在疟原虫检测中的应用

本研究探讨了用一步法实时荧光RT-PCR检测疟原虫核酸的可行性。分别用一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR两种扩增方法对不同稀释度的样本总RNA和基因组DNA进行检测,同时对20份疟原虫阳性血样进行检测。结果显示,一步法实时荧光RT-PCR可检测到的稀释度最高,比实时荧光PCR高1000倍。运用一步法实时荧光RT-PCR方法检测出20份全部阳性样本,检出率为100%;实时荧光PCR方法检测出18份阳性样本,检出率为90%。结果表明,一步法实时荧光RT-PCR方法用于疟原虫检测比实时荧光PCR方法更具有优势,敏感性更强,准确性更高。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

弓形虫半巢式PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因（X14080）设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504bp片段与P30基因（X14080）的序列同源性为99.8%。该PCR检测体系的特异性强,不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为18fg。     

嗜肺军团菌血清1型荧光PCR检测方法的研究

本研究利用嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因,设计并筛选出一对实时荧光PCR引物和Taq Man探针,建立了嗜肺军团菌血清1型(Lp1)实时荧光PCR检测方法。特异性试验显示,3株Lp1出现了典型的扩增曲线,23株近源参考菌株没有扩增。灵敏度试验显示,水中Lp1的检测底线可达到1.1×10² CFU/mL。重复性试验结果显示,高、中、低浓度扩增Ct值相对标准偏差分别为0.51%、0.42%、0.31%。结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、重复性好、检测流程短,适于水环境污染状况调查及应急事件快速检测。     

食品中鸡、鸭源性成分单向测序鉴定的方法探索

目的:建立食品中鸡、鸭源性成分的单向测序鉴定方法。方法:动物组织经蛋白酶K消解后,用全自动核酸提取仪提取DNA,以提取DNA作为模板,由特异引物进行PCR扩增,扩增产物经毛细管电泳仪鉴定,将目的扩增条带回收后进行测序鉴定。结果:鸡、鸭两种动物的目的扩增条带经单向测序后分别与SN/T2978-2011及SN/T 3731.5-2013中鸡、鸭参考序列进行同源比对,同源性达到100%。本方法的鸡、鸭肉最低检出限为100 mg·kg-1。结论:该方法简单、准确、成本低,适用于食品中鸡、鸭源性成分鉴定。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M基因核苷酸序列设计一对特异性引物,扩增位置在M基因的14744～14846位,片段长度为103bp。提取PRRS RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测PRRSV的方法。并用该方法检测送检的临床疑似病料,结果表明,本研究建立的PRRSV-SYBR Green I PCR特异性强,操作简单,耗时短,只需3h即可完成整个实验过程,可初步用于临床检测。     

用FQ-PCR方法快速检测水产品中副溶血弧菌

[目的]采用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测与鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量检测试剂盒.[方法]根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线.以副溶血弧菌菌株8株及同源及非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测.同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测.[结果]该方法有良好的特异性8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其他24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,其它15株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.9871.直接进行定量检测,则检测低限在102cfu/g;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfu/g.[结论]该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景.     

两种锥虫双重实时荧光PCR检测方法的建立

通过比较美洲锥虫和非洲锥虫基因组的保守性与特异性,设计2套锥虫特异性引物和探针用于核酸检测,美洲锥虫和非洲锥虫分别使用HEX和FAM荧光基团标记探针,建立美洲锥虫和非洲锥虫的双重实时荧光PCR检测方法,并对建立的方法进行灵敏度、特异性和重复性分析.结果显示,新建立的双重实时荧光PCR检测方法只对2种锥虫阳性对照模板有特...     

食品中单增李斯特菌快速、敏感、特异PCR检测方法的建立

[目的]建立食品中单增李斯特菌的PCR检测方法.[方法]根据单增李斯特菌的hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因各设计了一对引物,两对引物组合建立PCR方法,用人工污染食品对该方法进行验证,于37℃经24h预增菌和24h增菌后直接进行PCR分析.[结果]在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中单增李斯特菌的检出限为1cfu/25g(mL),在原奶和生肉中的检出限分别为1～10 cfu/25mL和25 cfu/25g.[结论]该方法快速、敏感、特异,适合不同类型食品的常规检测分析,可用于食品工业中单增李斯特菌的检测.     

PCR方法检测志贺氏菌的研究

建立一种快速检测志贺氏菌PCR检测方法.根据志贺氏菌的侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,设计引物,建立PCR检测方法.本方法特异性高,均能检测出志贺氏菌属的4个种,整个实验过程8～10h完成.建立的方法可用与实际检测中.