荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

荧光RT—PCR检测NDV人工感染肉鸡组织脏器的应用研究

用6株新城疫病毒分离株人工感染28日龄肉鸡,感染后3天采集咽喉拭子和泄殖腔拭子,对死亡鸡进行病理剖检,取心、肝、脾、肺、肾、小肠、腿肌、胸肌等,制备组织脏器悬液,作倍比稀释,用建立的荧光RT-PCR方法检测并同鸡胚分离比较.试验表明,荧光RT-PCR检测组织脏器和拭子的敏感性同鸡胚分离的敏感性基本一致,荧光RT-PCR检测脏器的最低检测量为5X10-5,肌肉的最低检测量为5X10-3,拭子的最低检测量为10-3.用不同的样品处理方法处理样品做荧光RT-PCR表明,裂解液处理样品方法优越,可提高检测灵敏度.     

玉米褪绿斑驳病毒抗体及TAS-ELISA试剂盒的研制

将纯化的玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus）制剂免疫家兔,获得兔多克隆抗体;将纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术获得1株分泌玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体。研制了多克隆抗体为包被抗体,单克隆抗体为检测抗体的TAS-ELISA试剂盒。     

盐酸克仑特罗检测试剂盒的研制

本研究通过将盐酸克仑特罗分别与自制血清白蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶联后,制成免疫原和包被抗原,利用单克隆抗体制备技术,制备了能够分泌抗盐酸克仑特罗的单克隆抗体细胞株.以自制血清白蛋白效价最好,且该株细胞分泌的抗体特异性强,与其它克仑特罗类药物无交叉反应.在筛选出盐酸克仑特罗单克隆抗体的基础上,首次研制出利用单克隆抗体对动物组织中残留的盐酸克仑特罗进行检测的试剂盒.本试剂盒的最低检测限为0.1ng/mL,检测范围为0.1-10ng/mL,通过对24份阳性样品检测并与德国r-biopharm公司和英国的RANDOX公司同类试剂盒作对比试验,阳性符合率95.8%.     

三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的研究

鱼传染性造血器官坏死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus IHNV）、鱼病毒性出血性败血症病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus VHSV）和鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus SVCV）是同属弹状病毒科（Rhabdoviridae）的3种鱼类病毒,也是影响水产养殖业的3种重要病毒。通过对这3种病毒基因序列的分析,在病毒基因的高保守区域,设计了3条分别针对这3种病毒的Taqman MGB探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。以此为基础建立针对该3种病毒的三重实时荧光RT-PCR的检测方法。通过反应条件的优化,该三重实时荧光RT-PCR最低可检测至102拷贝/反应的病毒量。同时,该方法还对病毒混合感染EPC细胞（Epithelioma papulosum cyprini）和攻毒斑马鱼进行了检测。实验结果表明,该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法。     

瘦肉精胶体金快速检测二联卡的研制

目的:研制用于现场检测肉制品中盐酸克伦特罗和沙丁胺醇(瘦肉精)的二联快速检测试纸条。方法:利用胶体金免疫层析技术,通过对标记抗体的pH、抗体浓度以及重悬液的条件优化进行二联卡的制备。结果:盐酸克伦特罗检出限为3 ng·mL~(-1),沙丁胺醇检出限达到5 ng·mL~(-1)。结论:瘦肉精快速检测二联卡灵敏度、特异性、稳定性、重复性都符合要求,可应用于肉制品和饲料样品的现场快速检测。     

荧光RT—PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液,并同时与鸡胚病毒分离比较表明,荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,最低为10-5,略低于鸡胚病毒分离.对23株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出,本课题建立的荧光RT-PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒.用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒,未发现交叉反应.     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

表达绿色荧光水泡性口炎复制缺陷重组病毒株的构建

水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）为弹状病毒科成员,传播媒介主要是节肢动物,可以感染啮齿类动物及牛、猪、马等多种动物,也可感染人类。VSV主要分为2个血清型,代表株分别是印第安株（Indiana）和新泽西株（New Jersey）。VSV感染引起的水泡性口炎（Vesicular stomatitis,VS）是一种急性高度接触性传染病。本研究拟利用反向遗传学技术构建水泡性口炎病毒印第安株拯救系统,通过构建稳定表达T7聚合酶的BHK21细胞系和表达VSV病毒缺失G蛋白的全长质粒以及辅助质粒,拯救出表达绿色荧光的VSV复制缺陷型病毒株,可为动物疫病提供检测技术支持,也可用于开发病原检测试剂和检测方法。     

荧光RT-PCR快速检测技术检测鸭场环境中禽流感病毒

本研究应用荧光RT-PCR方法和鸡胚病毒分离方法,对两个禽流感发病后康复鸭场和一个健康鸭场采集的环境样品、部分健康和死鸭的拭子脏器进行检测,结果显示荧光RT-PCR方法同病毒分离方法的符合情况较好,阴性符合率为100%,病毒分离检出阳性样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性.表明该方法在检测禽流感病毒的环境释放方面有重要应用价值,能够检出环境样品中的禽流感病毒.但其中的8份样品荧光RT-PCR显示为弱阳性或可疑,鸡胚分离的结果为阴性.推测这些样品中的病毒虽被灭活,但核酸并没有完全降解.     

鲤春病毒血症监测方法的应用研究

为提高鲤春病毒血症的监测效率,将细胞培养、酶联免疫吸附试验和PCR方法有机结合,先用细胞扩增病毒5d以提高后续检测的灵敏度,然后用酶联免疫吸附试验进行高通量初筛,最后对可疑阳性用PCR确认。虽然这样的联合检测方法比国标GB/T 15805.5-2008方法多了一个检测步骤,但是却能将检测时长缩短一半,提高了检测效率。经过在45个无临床症状样品上应用,结果显示,联合检测方法和国标方法的结果完全一致,且缩短了检测周期,提高了检测效率,能够发现样品早期感染状态,实现对鲤春病毒血症的高效监测。     

PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

猪伪狂犬病抗体免疫金标快速检测试纸法的建立和应用

应用免疫学原理与胶体金层析技术相结合,采用双抗原夹心法建立了检测猪伪狂犬病抗体水平的"猪伪狂犬病抗体免疫胶体金标快速检测试纸法",该法与美国Idexx公司的猪伪狂犬病ELISA试剂盒同时对16份猪血液或血清进行抗体水平检测,符合率达100%.同时对100份猪血液和对应血清进行检测,结果也相同.试验结果显示,本法与ELISA一样,具有微量、特异、准确等优点,且操作简易,而本方法不需要任何仪器,检测时间短,结果直观,容易判定,适用于基层兽医站、养猪场使用和大面积猪伪狂犬病抗体普查.     

基因芯片技术快速检测SARS病毒

以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测,结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好,稳定快速,在检验检疫中应用是可行的.     

基因芯片技术快速检测SARS病毒

本研究以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测,结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好,稳定快速,在检验检疫中应用是可行的.     

GICA检测高致病性禽流感抗体方法的建立

[目的] 建立可快速、简便地检测微量禽流感的抗体的方法.[方法] 利用灭活的高致病性禽流感病毒H5N1建立禽流感病毒浓缩纯化样品体系,获得大量纯度较高的禽流感病毒(1512).将2.80mg/mL纯化病毒与一定大小的胶体金颗粒偶联,吸附在玻璃纤维上,制作的高致病性禽流感病毒抗体胶体金检测试纸条,用于高致病性禽流感定量(合格)检测.[结果] 显色反应良好,条带稳定,检测获得成功.[结论] 其反应特异性、敏感性、重复性良好,具备微量、快速、简便的特点,适合于进出境现场检疫和疫情普查.     

用SN0539—1996标准进行肉品中青霉素残留量检验的探讨

1前言 近年来,出口肉品中青霉素残留问题已引起世界各国的高度重视,欧盟、美国、加拿大、日本等国家均规定了明确的限量要求,我国的兽药残留监控计划中青霉素也被列为重点检测项目之一.目前,肉品中青霉素的检测普遍采用SN0539-1996(出口肉品中青霉素残留量检验方法杯碟法)标准.但这一标准在实际操作中,在平板培养基的琼脂含量、青霉素标准液的储存时间、菌悬液的制备及用量测定、检定用平板的制备、标准曲线的制作及样品检测五个关键技术环节存在一定的局限性.为此,我们进行了大量有针对性的实验,总结出了克服上述问题的办法,从而使实验成功率与结果准确度得以提高.在此作简要介绍,以供检验工作者参考.     

鹅细小病毒延边株VP3基因原核表达质粒构建

本试验根据GenBank已公布的鹅细小病毒B株基因序列,设计了一对扩增VP3基因的特异性引物,对鹅细小病毒延边分离株基因组DNA进行了PCR扩增,得到了约为1500bp的VP3基因片段,将其回收纯化后与pMD-18T simple载体连接,然后进行克隆,经双酶切分析、PCR鉴定及测序,验证了所克隆的基因是鹅细小病毒VP3基因.用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表达载体中,获得重组质粒PGEM-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析,证实了重组质拉的正确性.     

纳米n-sic/ni-p复合电刷镀镀液及镀层性能分析

通过对n-sic/ni-p复合电刷镀技术的研究,将纳米颗粒材料和复合电刷镀技术有机地结合起来,配制n-sic/ni-p复合电刷镀液,优化普通电刷镀技术的工艺参数,制备含有纳米颗粒、性能优良的复合镀县,并分析该镀层的组织结构、显微硬度等试验结果.     

动物产品中17种有机氯、拟除虫菊酯残留同时测定的全自动固相萃取技术研究

本研究针对目前动物产品中有机氯、拟除虫菊酯残留检测干扰严重,必须进行繁琐的酸消化、硫酸磺化样品前处理问题,应用全自动固相萃取技术对动物产品中17种有机氯、拟除虫菊酯残留检测的样品前处理方法进行了系统的研究,对提取溶剂、固相萃取柱、淋洗液、洗脱溶剂及仪器分析条件进行了优化选择,建立了高效、快速、经济、安全的动物产品中有机氯、拟除虫菊酯残留同时检测的全自动固相萃取净化方法.经不同检测单位验证,该方法的加标回收率介于78.6%～103.0%之间,精密度(CV)为2.7%～12.1%,测定低限为0.005～0.010mg/kg,满足出口检测要求.