旋毛虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用研究

根据旋毛虫隔离种线粒体Ls-rRNA基因序列,设计一对特异性引物及TaqMan MGB探针。以Ls-rRNA阳性重组质粒为模板,建立了旋毛虫实时荧光PCR检测方法。该检测方法对各旋毛虫隔离种具有良好的特异性,而对小鼠、狗和猪正常肌肉组织、猪鞭虫、猪蛔虫、猪钩虫、犬蛔虫等无交叉反应。最小检出量为1.32×10^2拷贝（10^-5条旋毛虫）,建立的标准曲线拟合良好,扩增方程Y=-3.43X＋19.70,相关系数R^2=0.9984,扩增效率为95%。平行检测组内变异系数为1.11%（n=20）,同一组不同浓度梯度样本（n=9）间隔30d重复检测,结果无显著性差异。人工感染不同剂量猪旋毛虫的小鼠,在攻虫14d后检出率100%。对经压片镜检、人工胃液消化、胶体金试纸条检测结果为阴性的63份送检狗肉样本中敏感地检出8个阳性。     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

两种锥虫双重实时荧光PCR检测方法的建立

通过比较美洲锥虫和非洲锥虫基因组的保守性与特异性,设计2套锥虫特异性引物和探针用于核酸检测,美洲锥虫和非洲锥虫分别使用HEX和FAM荧光基团标记探针,建立美洲锥虫和非洲锥虫的双重实时荧光PCR检测方法,并对建立的方法进行灵敏度、特异性和重复性分析.结果显示,新建立的双重实时荧光PCR检测方法只对2种锥虫阳性对照模板有特...     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

实时荧光PCR法检测食品中芝麻过敏原成分

食品安全是现代社会不容忽视的一个问题,也是食品质量最重要、最基本的组成部分,食物过敏就属于食品安全问题。本文阐述食品过敏机制和过敏原特点,并利用实时荧光PCR法检测食品中芝麻过敏原成分,以供相关人员参考。     

进口冷冻肉类沙门氏菌快速检验方法的研究

〔目的〕建立一种简便、快速、灵敏、准确的沙门氏菌检验方法。〔方法〕以传统标准方法为基础,与实时荧光PCR快速检测技术结合使用。〔结果〕检验进口冷冻禽畜肉样品3177份,检出沙门氏菌105份。〔结论〕该方法的应用使沙门氏菌阴性样品得以快速放行,沙门氏菌阳性样品的鉴定更准确、科学,在进口动物源性食品的检验检疫工作中具有意义。     

应用荧光PCR方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌

[目的]发展一种快速、敏感、特异的荧光PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌.[方法]针对单增李斯特氏菌溶血素基因(hly A),设计特异的引物和TaqMan探针,优化体系,建立荧光PCR检测方法,对该方法的特异性和敏感性进行评价,并且在对188个进出口食品样本的检测中与传统方法进行对比.[结果]经对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株检测,结果显示该方法具有良好的特异性.灵敏度检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h.在实际样本的检测中,检测结果与传统方法结果一致.[结论]该方法能快速、简便和准确地检出单核细胞增生李斯氏菌,具有良好的应用前景.     

实时荧光定量PCR在食品微生物检测中的应用和质量控制

通过概述实时荧光定量PCR技术的原理、特点,以及其在食品微生物检测、转基因食品等领域的应用和质量控制情况,旨在为食品安全监测提供依据。     

MGB双探针实时荧光PCR检测牛白细胞粘附缺陷病方法的建立

从福建某奶牛场250头进口荷斯坦牛采血提取牛血液DNA,根据已知牛染色体上CD18编码基因序列383位碱基由A 变为G 而引起牛白细胞粘附缺陷病设计特异性野生型和突变型探针,建立实时荧光定量PC R 检测方法用于牛白细胞粘附缺陷病的基因分型检测。结果检出2头母牛为牛白细胞粘附缺陷病携带者,检出率为0.8%,没有发现患病牛。结果证明本研究建立的实时荧光定量PC R 检测方法是一种敏感性和特异性很高的筛选奶牛牛白细胞粘附缺陷病有害基因的新方法。     

一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限最低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。     

嗜肺军团菌血清1型荧光PCR检测方法的研究

本研究利用嗜肺军团菌O抗原基因簇wzt基因为靶基因,设计并筛选出一对实时荧光PCR引物和Taq Man探针,建立了嗜肺军团菌血清1型(Lp1)实时荧光PCR检测方法。特异性试验显示,3株Lp1出现了典型的扩增曲线,23株近源参考菌株没有扩增。灵敏度试验显示,水中Lp1的检测底线可达到1.1×10² CFU/mL。重复性试验结果显示,高、中、低浓度扩增Ct值相对标准偏差分别为0.51%、0.42%、0.31%。结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、重复性好、检测流程短,适于水环境污染状况调查及应急事件快速检测。     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。     

实时荧光定量PCR鉴别食品中猪源性成分的研究进展

本文针对目前鉴别食品中猪源性成分的方法,即实时荧光定量PCR技术进行综述,并展望其应用前景。     

空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究

空肠弯曲菌是世界卫生组织列为最常见食源性传染病菌之一的人兽共患病原菌,传统的分离鉴定方法需要耗费大量工时,并存在敏感性低、难以检出非可培养状态细菌和易出现假阴性结果等问题.本研究首创了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR快速检测方法,无需增菌培养即可直接捕获检样中的弯曲菌,利用实时荧光PCR进行鉴定,可在24h内完成检测,检测低限达到10cfu/mL,提高了非可培养状态空肠弯曲菌的检出率.     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法所用引物的特异性比较

[目的]对食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法目前常用的引物进行特异性比较.[方法]用36株单增李斯特氏菌、非单增李斯特氏菌以及其他菌属的细菌,将我室的2对引物与其他作者设计的5对引物进行特异性比较.[结果]我室采用的引物FM1/FM2只对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段,引物LI1/U1只对所有李斯特氏菌属的细菌扩增出特异性片段.其他引物除了对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段外,对其他细菌也会扩增出与特异性片段大小一致的片段.[结论]单增李斯特氏菌的特异引物FM1/FM2与李斯特氏菌属的特异引物U1/LI1组合应用,可以成为检测单增李斯特氏菌的最佳方法.     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

五种血清型柯萨奇病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

在柯萨奇病毒基因组VP1区设计引物和探针,分别建立了特异性检测5种血清型（A9、A16、B2、B3和B5型）柯萨奇病毒（Coxsackievirus）基于MGB探针的实时荧光RT-PCR方法。通过构建的分别适于5种血清型病毒检测的质粒标准分子对建立的检测体系进行了灵敏度分析,确定5种血清型柯萨奇病毒检测体系的检测下限均为2拷贝质粒标准分子DNA。     

BioLumix微生物实时荧光光电检测系统快速检测食品中致病菌的应用研究

食品微生物致病菌是食品质量的重要指标,本文将一种微生物荧光光电检测系统与传统国家标准检验方法在检测金黄色葡萄球菌上进行比较,得出了两种方法检测结果一致的结论,但是该检测系统相对于传统检测方法具有检测时间短、操作简单、可自动显示结果等优点。     

食品中单增李斯特菌快速、敏感、特异PCR检测方法的建立

[目的]建立食品中单增李斯特菌的PCR检测方法.[方法]根据单增李斯特菌的hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因各设计了一对引物,两对引物组合建立PCR方法,用人工污染食品对该方法进行验证,于37℃经24h预增菌和24h增菌后直接进行PCR分析.[结果]在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中单增李斯特菌的检出限为1cfu/25g(mL),在原奶和生肉中的检出限分别为1～10 cfu/25mL和25 cfu/25g.[结论]该方法快速、敏感、特异,适合不同类型食品的常规检测分析,可用于食品工业中单增李斯特菌的检测.