旋毛虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用研究

根据旋毛虫隔离种线粒体Ls-rRNA基因序列,设计一对特异性引物及TaqMan MGB探针。以Ls-rRNA阳性重组质粒为模板,建立了旋毛虫实时荧光PCR检测方法。该检测方法对各旋毛虫隔离种具有良好的特异性,而对小鼠、狗和猪正常肌肉组织、猪鞭虫、猪蛔虫、猪钩虫、犬蛔虫等无交叉反应。最小检出量为1.32×10^2拷贝（10^-5条旋毛虫）,建立的标准曲线拟合良好,扩增方程Y=-3.43X＋19.70,相关系数R^2=0.9984,扩增效率为95%。平行检测组内变异系数为1.11%（n=20）,同一组不同浓度梯度样本（n=9）间隔30d重复检测,结果无显著性差异。人工感染不同剂量猪旋毛虫的小鼠,在攻虫14d后检出率100%。对经压片镜检、人工胃液消化、胶体金试纸条检测结果为阴性的63份送检狗肉样本中敏感地检出8个阳性。     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

目的:弗尼斯弧菌(Vibrio fumissii)是引起世界范围内胃肠功能紊乱的致病菌之一,一般通过摄人生的或者未煮熟的水产品进行传播。本研究旨在建立高效、可靠的PCR检测方法应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。方法和结果:根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计普通PCR引物及实时PCR引物、探针,建立普通PCR和实时荧光PCR方法,分别对两种方法的特异性和灵敏度进行比较分析,同时应用于384份食品样品检测。结果表明,建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为:2.4×10^3 CFU/ml和24 CFU/ml,并于5 h内完成整个检测过程,同时对384份食品进行检测,共检出6株阳性菌株。结论:本研究建立的PCR检测技术灵敏度高、特异性好,可应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

[目的]针对牛传染性鼻气管炎病毒建立快速、准确而敏感的分子生物学检测方法,为进出口牛及其遗传物质的IBR检疫把关提供新的技术手段.[方法]采用新型实时荧光PCR技术原理,自行设计荧光标记引物建立检测方法,对不同牛传染性鼻气管炎病毒样品进行敏感性、特异性等检测试验,并与常规PCR检测方法进行比较.[结果]该方法能特异检测I BR病毒,检测时间包括核酸样品制备仅需2h,敏感性比常规PCR检测方法提高达103-104.[结论]本方法适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定.     

两种锥虫双重实时荧光PCR检测方法的建立

通过比较美洲锥虫和非洲锥虫基因组的保守性与特异性,设计2套锥虫特异性引物和探针用于核酸检测,美洲锥虫和非洲锥虫分别使用HEX和FAM荧光基团标记探针,建立美洲锥虫和非洲锥虫的双重实时荧光PCR检测方法,并对建立的方法进行灵敏度、特异性和重复性分析.结果显示,新建立的双重实时荧光PCR检测方法只对2种锥虫阳性对照模板有特...     

实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒

对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）感染引起,所有养殖对虾对该病高度易感,蟹类、小龙虾、淡水虾以及各种龙虾也易感,但发病率和死亡率有很大差别。多种虾类常表现为持续感染或终身隐性感染。隐性感染虾体内的病毒含量极低,需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法。本文应用TaqMan探针技术设计了探针和引物,建立了检测WSSV的实时荧光定量PCR方法。对影响PCR反应的主要因素Mg^2＋浓度和退火温度等进行了优化,证明当Mg2＋浓度为3.5～4.0 mmol,退火温度为59～60℃时可获得最佳的扩增和检测效果。     

荧光定量PCR法检测中国籍海员血清HBV DNA

[目的] 了解远洋海员HBV DNA的实际感染情况,为国境口岸传染病监测策略提供基础数据.[方法] 选广州某口岸2003年3月至12月中国籍远洋海员体检血清标本192例,用ELISA法检测192份血清乙肝五项免疫学指标,以HBSAG阳性121例为实验组,51例HBSAG阴性为对照组.用实时荧光定量PCR法同时检测HBV DNA病毒含量.比较两组HBVDNA检出差异.[结果] 192名远洋海员HBVDNA检出78例(40%).5项血清免疫学指标和HBV DNA全部阴性18例.实验组HBV DNA阳性64例(50.02%),对照组HBVDNA阳性14例(27.45%),两组差异有显著意义(χ2<0.01).14例HBSAG阴性HBV DNA阳性血清中,现行法规规定的三项传染性指标均为阴性,核心抗体均为阳性.[结论] 三项传染性指标阴性的人群仍有传播HBV的危险,建议有关部门修订远洋海员等特殊人群乙肝防治政策,直接检测HBV DNA.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

MGB双探针实时荧光PCR检测牛白细胞粘附缺陷病方法的建立

从福建某奶牛场250头进口荷斯坦牛采血提取牛血液DNA,根据已知牛染色体上CD18编码基因序列383位碱基由A 变为G 而引起牛白细胞粘附缺陷病设计特异性野生型和突变型探针,建立实时荧光定量PC R 检测方法用于牛白细胞粘附缺陷病的基因分型检测。结果检出2头母牛为牛白细胞粘附缺陷病携带者,检出率为0.8%,没有发现患病牛。结果证明本研究建立的实时荧光定量PC R 检测方法是一种敏感性和特异性很高的筛选奶牛牛白细胞粘附缺陷病有害基因的新方法。     

一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限最低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。     

食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR检测方法研究

利用沙门氏菌fim Y基因设计特异性引物、探针,优化叠氮溴化丙锭(propidium azide bromide,PMA)染料浓度及相关反应条件,使用高亮度蓝色发光二极管(Light Emitting Diode,LED)光解仪代替卤素光源,建立了食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR快速检测方法。实验表明,设计的引物、探针特异性强,能特异性扩增7株沙门氏菌,其他非沙门氏菌均无扩增,对沙门氏菌纯培养物检测灵敏度可达10² CFU/m L。经反应条件优化后,在PMA浓度为20μmol/L,暗反应5 min,曝光反应10 min条件下,对10⁶ CFU/m L的沙门氏菌热致死菌抑制效果最好,活菌的扩增不受影响。利用优化的PMA处理方法结合Taq Man实时荧光PCR和不经PMA处理的Taq Man实时荧光PCR,分别检测3种不同浓度(5 CFU/25 g、50 CFU/25 g、500 CFU/25 g)活菌和高浓度死菌(10⁶ CFU/25 g)的沙门氏菌人工混合污染样品,以及仅高浓度沙门氏菌死菌污染的人工污染样...     

主要呼吸道腺病毒荧光定量PCR检测方法建立与应用

本研究针对引I起人呼吸道感染的腺病毒B组(3型、7型、11型、14型、16型、21型、50型、55型)、C组(1型、2型、5型、6型、57型)和E组(4型)设计2组通用型引物探针,建立了主要呼吸道腺病毒荧光定量PCR检测方法,并测试方法的灵敏度、重复性、特异性,同时应用于临床样本测试.结果显示,该方法可特异性检出呼吸道...     

三种禽用疫苗外源病原多重荧光PCR检测方法建立

根据GenBank中收录的鸡毒支原体、禽白血病病毒和网状内皮细胞增生症病毒的基因序列,分别设计并合成了引物和相应的荧光探针,通过对反应条件和反应程序的优化,建立了一种可以同时检测3种禽用疫苗外源性病原污染因子的三重荧光PCR检测方法。结果显示,建立的三重荧光PCR灵敏度高,最低可检测到10 copies/μL的质粒,并具有良好的特异性,可用于禽用疫苗外源性污染因子的快速检测,也可用于相关疫病的诊断。     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。     

实时荧光定量PCR在食品微生物检测中的应用和质量控制

通过概述实时荧光定量PCR技术的原理、特点,以及其在食品微生物检测、转基因食品等领域的应用和质量控制情况,旨在为食品安全监测提供依据。     

空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究

空肠弯曲菌是世界卫生组织列为最常见食源性传染病菌之一的人兽共患病原菌,传统的分离鉴定方法需要耗费大量工时,并存在敏感性低、难以检出非可培养状态细菌和易出现假阴性结果等问题.本研究首创了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR快速检测方法,无需增菌培养即可直接捕获检样中的弯曲菌,利用实时荧光PCR进行鉴定,可在24h内完成检测,检测低限达到10cfu/mL,提高了非可培养状态空肠弯曲菌的检出率.     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

应用数字PCR对新型冠状病毒核酸检测结果的分析

比较数字PCR(dPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的结果,为利用dPCR对SARS-CoV-2含量低的样品进行核酸检测提供数据支持.利用dPCR和qPCR对济宁市17份新型冠状病毒肺炎(COVID-19)核酸样本进行N基因和ORF1ab基因检测.qPCR检测N基因1...     

实时荧光PCR法检测食品中芝麻过敏原成分

食品安全是现代社会不容忽视的一个问题,也是食品质量最重要、最基本的组成部分,食物过敏就属于食品安全问题。本文阐述食品过敏机制和过敏原特点,并利用实时荧光PCR法检测食品中芝麻过敏原成分,以供相关人员参考。     

双重荧光PCR方法快速鉴定斑鳖与幼发拉底斑鳖的研究

建立同时鉴别检测幼发拉底斑鳖和斑鳖的双重荧光PCR方法.通过对鳖科动物细胞色素b基因序列比对,针对幼发拉底斑鳖和斑鳖,设计合成通用引物和特异性鉴别探针,经反应体系和反应参数优化,建立了快速检测鉴定幼发拉底斑鳖和斑鳖成分的TaqMan双重荧光PCR方法.特异性试验结果显示,建立的方法可以快速、准确地鉴定幼发拉底斑鳖和斑鳖...     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。