实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

三种禽用疫苗外源病原多重荧光PCR检测方法建立

根据GenBank中收录的鸡毒支原体、禽白血病病毒和网状内皮细胞增生症病毒的基因序列,分别设计并合成了引物和相应的荧光探针,通过对反应条件和反应程序的优化,建立了一种可以同时检测3种禽用疫苗外源性病原污染因子的三重荧光PCR检测方法。结果显示,建立的三重荧光PCR灵敏度高,最低可检测到10 copies/μL的质粒,并具有良好的特异性,可用于禽用疫苗外源性污染因子的快速检测,也可用于相关疫病的诊断。     

五种血清型柯萨奇病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

在柯萨奇病毒基因组VP1区设计引物和探针,分别建立了特异性检测5种血清型（A9、A16、B2、B3和B5型）柯萨奇病毒（Coxsackievirus）基于MGB探针的实时荧光RT-PCR方法。通过构建的分别适于5种血清型病毒检测的质粒标准分子对建立的检测体系进行了灵敏度分析,确定5种血清型柯萨奇病毒检测体系的检测下限均为2拷贝质粒标准分子DNA。     

实时荧光PCR技术检测4种常见高组胺鱼成分方法的建立及初步应用

为建立针对常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法,本研究以日本鲭的ATP-6基因、金枪鱼的BGH基因、秋刀鱼和沙丁鱼的Cytb基因为靶基因设计特异性的引物和探针,并通过反应体系的优化试验、特异性试验和灵敏性试验,建立了针对4种高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对其他常见鱼类物种均无特异性扩增,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼的灵敏性可分别达到10.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL、1.0 pg/μL;以人工模拟样品进行检出限分析,建立的实时荧光PCR方法的检出限均可达0.1%;对市售的36份鱼肉制品进行检测,日本鲭、沙丁鱼、秋刀鱼和金枪鱼成分的检出率分别为11.11%(4/36)、5.56%(2/36)、5.56%(2/36)和16.67%(6/36)。本研究建立的针对4种常见高组胺鱼成分的实时荧光PCR检测方法,操作简便、结果可靠,可为我国鱼肉制品进出口检验监管和食品安全监管提供技术支撑。     

贝类产品中诺沃克病毒的实时荧光RT—PCR检测方法研究

诺沃克病毒是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒,主要存在于牡蛎、文蛤等贝类中.本研究建立了从贝类中提取诺沃克病毒RNA的方法以及进行实时荧光RT-PCR检测的方法.     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Yvein necrosis strain,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本研究根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP）基因序列保守区域,设计合成了两对巢式PCR引物和一条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Real-time PCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Real time PCR等方法高。该方法检测灵敏度可达3 fg/μL植物总RNA。利用四对引物和一条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,检测的准确性比其它方法高。     

荧光RT-PCR检测鱼类鲤春病毒血症病毒的研究

本研究根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的检测鲤春病病毒的荧光RT-PCR检测技术.同时,又将该方法与一步法RT-PCR方法和细胞查毒方法进行了互相验证和对比研究,结果表明,荧光RT-PCR方法检测病毒悬液的灵敏度最高,病毒悬液10-6稀释仍然可以检出,而细胞分离病毒方法测得的TCID50为10-4.本文还对北京地区出口渔场送检样品、人工实验感染该病毒鱼的病料进行了组织脏器中病毒分布和病毒含量的研究.结果显示,北京地区出口渔场送检样品未见细胞病变,所有检测样品均为阴性;病毒致死鱼的肠道病毒含量最高,肠组织研磨稀释10-4倍仍然可以检出;其次是肾和鳃组织,检出极限为稀释10-3倍组织悬液;肉和脑组织中病毒含量较低,肉最高能检出10-2倍组织悬液,而脑组织只能检出10-1倍组织稀释液.     

一步法实时荧光RT-PCR在疟原虫检测中的应用

本研究探讨了用一步法实时荧光RT-PCR检测疟原虫核酸的可行性。分别用一步法实时荧光RT-PCR和实时荧光PCR两种扩增方法对不同稀释度的样本总RNA和基因组DNA进行检测,同时对20份疟原虫阳性血样进行检测。结果显示,一步法实时荧光RT-PCR可检测到的稀释度最高,比实时荧光PCR高1000倍。运用一步法实时荧光RT-PCR方法检测出20份全部阳性样本,检出率为100%;实时荧光PCR方法检测出18份阳性样本,检出率为90%。结果表明,一步法实时荧光RT-PCR方法用于疟原虫检测比实时荧光PCR方法更具有优势,敏感性更强,准确性更高。     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯黑环斑病毒的研究

马铃薯黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）是马铃薯重要病毒病害之一。本研究根据PBRSV基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）保守序列,设计合成了两对巢式PCR引物和1条Taq-MAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Realtime PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM试剂盒快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达450fg/μL植物总RNA。利用4对引物和1条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。     

鲤春病毒血症监测方法的应用研究

为提高鲤春病毒血症的监测效率,将细胞培养、酶联免疫吸附试验和PCR方法有机结合,先用细胞扩增病毒5d以提高后续检测的灵敏度,然后用酶联免疫吸附试验进行高通量初筛,最后对可疑阳性用PCR确认。虽然这样的联合检测方法比国标GB/T 15805.5-2008方法多了一个检测步骤,但是却能将检测时长缩短一半,提高了检测效率。经过在45个无临床症状样品上应用,结果显示,联合检测方法和国标方法的结果完全一致,且缩短了检测周期,提高了检测效率,能够发现样品早期感染状态,实现对鲤春病毒血症的高效监测。     

昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT—PCR检测方法的建立

[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7．0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限：昆津病毒1．83106copies／μL,巴马哈森林病毒2．02×106copies／μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。     

3种ELISA试剂盒对牛新孢子虫血清抗体比较检测

用瑞典Svanova公司、美国IDEXX公司和美国VMRD公司生产的3种检测新孢子虫血清抗体ELISA试剂盒对来自澳大利亚牛血清（41份）、新西兰牛血清（40份）、乌拉圭牛血清（30份）和中国新疆牛血清（46份）进行了同步检测和比较分析,并以其中2个试剂盒检测结果均为阳性或阴性的血清为真阳性或真阴性,对另1个试剂盒在诊断相对敏感性和相对特异性方面进行了比较评估。结果表明,3个试剂盒的诊断相对敏感性和诊断相对特异性分别为：85.7%和92.5%（Svanova）、95.8%和98%（IDEXX）、88.5%和98%（VMRD）。3个试剂盒都具有较好的重复性,检测低限相近。在对样品的检测中,IDEXX与VMRD两个试剂盒检测符合率较高,但对不同国家的样品检测符合率差别较大。     

液相色谱-串联质谱测定枸杞、大青叶等中药材中6种黄曲霉毒素

建立了中药材中6种黄曲霉素毒素的液相色谱串联质谱测定方法。中药材样品经粉碎后,采用70％的甲醇溶液高速搅拌、超声提取,提取液经免疫亲和柱净化后采用液相色谱一串联质谱仪测定黄曲霉毒素,外标法定量。可同时检测样品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2等6种黄曲霉毒素。方法的检出限为0.3μg／kg,定量限为1μg／kg,各基质在1μg／kg、5μg／kg、10μg／kg等3个水平的添加回收率（n=5）为78．9％-100.2％,相对标准偏差为4．2％-12．6％。该方法的检测速度快,基质干扰较少,结果准确、可靠,定量限可满足国内外对中药材黄曲霉毒素相关限量的要求。     

酶联免疫法与液相色谱-串联质谱法测定水产中氯霉素残留

运用酶联免疫法和液相色谱-串联质谱法测定水产中的氯霉素残留。结果显示,ELISA法最低检测限为0.0125μg/kg,鱼、虾、贝类样本的添加回收率为80.4%-101.3%,变异系数为5.7%-11.5%;LC-MS/MS法最低检测限为0.1μg/kg,样本添加回收率为82.7%-98.2%,变异系数为6.2%-9.7%。用酶联免疫法对实际样品进行检测,筛选出5个阳性样本,经液相色谱-串联质谱法确证亦为阳性,且测定结果一致。研究表明,酶联免疫法快速、灵敏、可靠,为水产品中氯霉素的残留检测提供了快速筛选方法,而液相色谱-串联质谱法准确度高,适用于阳性样本的确证和精确定量。     

婴幼儿食品微生物及微生物毒素调查分析

对婴幼儿食品（配方乳粉、补充谷物、饼干和罐头）分别进行微生物污染以及微生物毒素调查。调查结果表明：357份婴幼儿食品均未检出沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌;11份婴幼儿配方乳粉、1份补充谷物和1份饼干食品中检出坂崎肠杆菌,检出率分别为4.2%,2.4%和2.5%;检出1份补充谷物菌落总数超过国家标准最高安全限量值。13份婴幼儿配方乳粉和3份补充谷物检出肠杆菌科细菌,检出率分别为32.5%和7.1%;14份（婴幼儿）配方乳粉、2份婴幼儿罐头检出蜡样芽孢杆菌,检出率分别为35%和20%;1份婴幼儿配方乳粉检出黄曲霉毒素M1超标。婴幼儿食品存在微生物及其微生物毒素污染的风险,应加强对婴幼儿食品的致病微生物及其毒素的监测和监管。     

固相萃取-气相色谱法同时检测出口绿豆中的7种农药残留

本文采用固相萃取-气相色谱配电子捕获检测器法（SPE-GC/ECD）,建立了绿豆中7种农药（毒死蜱、三氯杀螨醇、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯）多残留的简单快速测定方法,检出限1.6～4.2μg/kg,在0.005～0.5μg/mL范围内线性关系良好,r在0.9978～0.9998间,在0.055、0.100、0.205μg/mL 3个添加浓度水平上平均回收率在89.5～122.4%,精密度（RSD）为2.68～9.61%。本方法能够减少复杂样品基质的背景干扰,操作简单,分析成本低,检测结果灵敏、可靠,适用于日常工作中大批量出口绿豆农残检测。     

新布尼亚病毒流行病学及检测方法的研究进展

着重对近期关于新布尼亚病毒基本特性、国内外流行病学特点、检测方法等方面的研究进展进行综述。应用原子力显微镜观测病毒的基本形貌获得相关数据;流行病学方面SFTS病例也陆续在日本、韩国等国家有发现和报道;检测方面除针对病毒不同基因组的荧光定量方法外,还有反转录环介导的等温扩增技术,以及通过将反转录交叉启动扩增和垂直流偶联快速准确的检测该病毒。