食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法所用引物的特异性比较

[目的]对食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法目前常用的引物进行特异性比较.[方法]用36株单增李斯特氏菌、非单增李斯特氏菌以及其他菌属的细菌,将我室的2对引物与其他作者设计的5对引物进行特异性比较.[结果]我室采用的引物FM1/FM2只对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段,引物LI1/U1只对所有李斯特氏菌属的细菌扩增出特异性片段.其他引物除了对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段外,对其他细菌也会扩增出与特异性片段大小一致的片段.[结论]单增李斯特氏菌的特异引物FM1/FM2与李斯特氏菌属的特异引物U1/LI1组合应用,可以成为检测单增李斯特氏菌的最佳方法.     

食品中单增李斯特菌快速、敏感、特异PCR检测方法的建立

[目的]建立食品中单增李斯特菌的PCR检测方法.[方法]根据单增李斯特菌的hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因各设计了一对引物,两对引物组合建立PCR方法,用人工污染食品对该方法进行验证,于37℃经24h预增菌和24h增菌后直接进行PCR分析.[结果]在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中单增李斯特菌的检出限为1cfu/25g(mL),在原奶和生肉中的检出限分别为1～10 cfu/25mL和25 cfu/25g.[结论]该方法快速、敏感、特异,适合不同类型食品的常规检测分析,可用于食品工业中单增李斯特菌的检测.     

单增李斯特菌选择性增菌培养和分离方法的比较研究

首先对改良的FDA法、NGFIS法、SN法和国标法4种李斯特菌选择性增菌和分离方法进行比较,结果表明对于人工污染的样品(生猪肉、虾、牛奶),各种增菌方法的检测灵敏度都较高,均能检出样品中<10CFU/g的单增李斯特菌;但对于不同自然样品(生猪肉、调理食品、虾和牛奶)的李斯特菌检出,则以改良的FDA法最佳.本项目设计了英诺克李斯特菌和单增李斯特菌的竞争性试验,明确当样品中含有英诺克李斯特菌时,增菌时间应缩短.     

乳粉中单增李斯特氏菌的污染情况调查

为保证乳粉食品的安全,采用本室建立的奶粉中单增李斯特菌的传统检验方法.对国内外生产的82份不同品牌的奶粉进行了单增李斯特氏菌的调查研究.结果未检出单增李斯特氏菌.     

应用荧光PCR方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌

[目的]发展一种快速、敏感、特异的荧光PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌.[方法]针对单增李斯特氏菌溶血素基因(hly A),设计特异的引物和TaqMan探针,优化体系,建立荧光PCR检测方法,对该方法的特异性和敏感性进行评价,并且在对188个进出口食品样本的检测中与传统方法进行对比.[结果]经对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株检测,结果显示该方法具有良好的特异性.灵敏度检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h.在实际样本的检测中,检测结果与传统方法结果一致.[结论]该方法能快速、简便和准确地检出单核细胞增生李斯氏菌,具有良好的应用前景.     

干奶粉中单增李斯特氏菌的生存评估

[目的]对不同水活度干奶粉中的单增李斯特氏菌在不同温度条件下的生存特性进行评估.[方法]通过人工方法将单增李斯特氏菌按103cfu/g的浓度添加于不同水活度的干奶粉样品中,在不同温度(冰箱温度4℃和室温25℃)下贮存,通过菌落计数来分析单增李斯特氏菌的生存特性.[结果]在低温条件下,单增李斯特氏菌可在较低水活度的干奶粉中长期保持生长活力,并且当水活度较高时,会有增长趋势.在较高的环境温度中,干奶粉中的单增李斯特氏菌的生长活力很快减退,细菌处于亚损伤状态,但在适宜的营养环境条件下,这种亚损伤状态可以得到修复.细菌仍然可以恢复活力.[结论]高温条件更易使干奶粉中单增李斯特氏菌生长活力减退,干奶粉中如果污染了单增李斯特氏菌.于室温(25℃)条件下贮存会抑制单增李斯特氏菌的生长.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

利用IMS／PCR方法快速检测食品中单增李斯特菌

研究用免疫磁珠(1mmunomagnetic separation,IMS)和复合PCR(multiplex-PCR)联用方法,从样品中直接浓缩获取单增李斯特菌(Listeria monocytogenes).针对L.monocytogenes的Listeriolysin O基因和李斯特菌属的23S rRNA设计两对特异性引物,作为Polymerase Chain Reaction(PCR)的靶基因,经PCR反应分别得到700bp和240bp.用IMS/PCR方法和SN方法同时检测了样品162份,结果通过API方法确证,符合率达到100%.结果表明,本文建立的IMS/PCR方法较常规方法简便、快速、灵敏度高,灵敏度可达1.5CFU/mL,在24h可快速检出L.monocytogenes,有很好的应用前景和研究价值.     

同时检测食品中的多种致病性弧菌

以食品中的致病性弧菌为研究对象,对培养基的选择、培养温度等关键因素进行实验研究,精心设计可疑菌落鉴定程序,形成同时检测几种致病性弧菌的同一检测程序.对新建方法进行验证发现,新建方法对17株(13种)致病性弧菌和4株相似菌的检测均与实际相符;新方法的灵敏度小于10个/25g;我们用新建方法对200份样品进行了检测,检出副溶血弧菌3例、拟态弧菌1例,SN标准对霍乱弧菌和副溶血弧菌的检测结果与新建方法一致.     

检测单增李斯特氏菌的几种选择性固体培养基的效果比较

[目的]选择更加适合单增李斯特氏菌检测的固体选择性培养基.[方法]参见ISO/TS11133-2中的培养基验证方法并有所改进,对国际上常用的3种选择性固体培养基进行比较选择.[结果]OXA和李斯特氏;显色培养基的增菌效果相近,且单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌在李斯特氏菌显色培养基上具有特征性菌落形态,易于与其他李斯特氏菌相区别.[结论]OXA和李斯特氏菌显色培养基效果较好,比较适合单增李斯特氏菌的检测,两种培养基联合使用可以提高单增李斯特氏菌的检出率.     

复水奶粉中单增李斯特氏菌的生存评估

[目的]对复水奶粉中单增李斯特氏菌的生长与存活进行评估.[方法]通过人工方法以102cfu/mL的浓度添加单增李斯特氏菌于复水奶粉样品中,在不同温度和pH值条件下贮存,通过菌落计数分析单增李斯特氏菌的生存特性.[结果]在-1.5～37℃之间,单增李斯特氏菌能够生长,在-1.5℃时生长速率最慢,随温度升高生长速率也随之加快,在37℃时生长最快,在45℃时不能生长.在接近中性pH值范围内的复水奶粉中,单增李斯特氏菌在高温条件下(30℃)比在低温条件下(4℃)生长快,但在低温条件下(4℃),单增李斯特氏菌对酸和碱的耐受程度比在高温条件下(30℃)的耐受程度大.[结论]由于复水奶粉的pH值接近中性,比较适合单增李斯特氏菌的生长,如果污染了单增李斯特氏菌,在低温条件下贮存能够控制单增李斯特氏菌的生长.     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验探讨

本文概述了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法,并对增菌、二次增菌、分离培养和生化实验的注意事项提出见解,为准确地检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌提供参考。     

几种液体培养基对奶粉中单增李斯特氏菌富集效果的比较

[目的]选择适合奶粉中单增李斯特氏菌富集的液体培养基.[方法]参考ISO/TS11133-2中的培养基验证方法并有所改进,对国际上常用的5种液体培养基进行比较选择.[结果]5种液体培养基对奶粉中单增李斯特菌的增菌效果差异不显著.[结论]5种液体培养基的增菌效果基本相同.但由于BLEB的增菌过程是先用无添加剂的肉汤预增菌后再加入添加剂,Fraser肉汤的增菌过程是用含有半量添加剂的肉汤预增菌后再转入含有全量添加剂的肉汤中,这两种方法有利于使损伤的细菌得以恢复活力.对奶粉中单增李斯特氏菌进行富集,如果采用一步增菌法建议使用BLEB,如果采用两步增菌法建议采用Fraser肉汤.     

食品中阪崎肠杆菌和单增李斯特氏菌检测能力验证结果与分析

目的:验证本实验室对食品中阪崎肠杆菌和单增李斯特氏菌的检出能力。方法:按照能力验证作业指导书、《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》(GB 4789.40-2010)和《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》(GB 4789.30-2010)进行检验。结果:样品14-P346检出阪崎肠杆菌,样品14-T795检出单核细胞增生李斯特氏菌。结论:组织者对本实验室此次能力验证实验结果评价满意,说明本实验室同时具有阪崎肠杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力。     

前增菌时间对生禽肉中沙门菌检验的影响研究

目的:研究不同前增菌时间对沙门菌检验的影响,对沙门菌检验方法进行优化,为国家标准的修订提供科学数据。方法:按照沙门菌国家标准方法检验20份生禽肉,每个样品分别采用8h和18h两个时间前增菌,对检验结果进行比较分析。结果:当前增菌时间为8 h时,检出沙门菌阳性样品8份,阴性样品12份;当将样品继续前增菌至18 h时,其中4份阳性样品中沙门菌未检出,5份阴性样品则检测为沙门菌阳性。结论:不同前增菌时间对沙门菌的检验影响显著,同时采用8h和18h两个前增菌时间检验生禽肉,可以大大提高阳性检出率。     

奶粉中单增李斯特氏菌热抵制特性的研究

[目的]对奶粉中单增李斯特氏菌的热抵制特性进行研究.[方法]通过人工方法将单增李斯特氏菌按107cfu/mL的浓度分别添加于提前预热的60℃的灭菌蒸馏水、复水的原料粉和复水的高糖高脂奶粉中,在此温度下分别作用5min和10min,通过菌落计数分析单增李斯特氏茵的热抵制特性.[结果]在灭菌蒸馏水中单增李斯特氏菌衰减得最快,在复水的原料奶粉中单增李斯特氏菌衰减得较慢,而在复水的高糖高脂奶粉中单增李斯特氏菌衰减得最幔.[结论]奶粉中的单增李斯特氏菌具有热抵制特性,而且高糖高脂成分可提高单增李斯特氏菌的热抵制能力.     

法国食品微生物实验室能力测试

食品微生物的实验室能力测试计划(简称RAEMA),始创于1988年,至今有440个实验室参加.涉及检测范围包括沙门氏菌、单增李斯特菌的定性检测及需氧微生物、肠道菌、类大肠菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、革兰氏阳性葡萄球菌、单增李斯特菌的定量检测.该计划每年实施2次,每次5个样品分发给各参加实验室,以验证各实验室对微生物检测、计数的准确度和精密度方面的能力.结果显示食品微生物实验室无论在质量保证体系方面还是在标准及确证分析方法的使用方面均有很大提高,而且获得有问题和不满意结果的实验室的百分率却保持相对恒定.     

应用PCR技术同步检测动物产品中的4种致病菌

本研究根据沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157H7及空肠弯曲菌的不同培养特性,将单一PCR及复合PCR的方法相结合,设计合成了4种针对性的引物,通过检测4种菌不同的特异性基因片段,建立了一种同步检测的PCR方法,具有简便、快速、准确的特点.对95份实物样品检测,结果与经典方法一致,有较好的应用价值.     

以oprI为靶基因实时荧光PCR法检测化妆品中绿脓杆菌

建立快速检测化妆品中绿脓杆菌的实时荧光PcR方法。选取绿脓杆菌oprI基因中相对保守且高度特异的核苷酸片段作为荧光PCR扩增的靶序列,设计引物和TaqMan探针,并研究了DNA提取方法,优化扩增反应体系和仪器条件。与GB方法进行比对,检测结果一致,但检测时间均只有GB方法的1／10;方法的检测灵敏度为2cFu／荧光PcR反应体系,染菌样品经6h增菌培养后,检测低限均达到2cFu／g,证明该方法高度敏感;通过对36株标准／参考菌株和51株非目的菌的检测,证实该方法高度特异;批内cP值的变异系数小于2％,说明该方法具有良好的可重复性。     

李斯特菌比对试验分析与探讨

参照广东出入境检验检疫局非标方法GDFB161-2002、Reveal李斯特菌快速检测方法以及国家标准GB/T 4789-30-2003等标准方法,对广东局食检中心派发的实验样品进行了比对试验,并对影响检测结果的因素进行了分析和探讨.