蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子”病病原鉴定中的应用

在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患"红脖子"的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属.     

鸡新城疫病毒强弱毒株RT—PCR鉴别诊断方法

本研究通过对不同毒力的新城疫病毒(NDV)的融合蛋白基因(F基因)核苷酸序列分析,根据毒力和序列间的相关规律,分别设计出3对引物P1+P2,P1+P3,P1+P4,建立了一种可以迅速鉴定新城疫病毒并且同时鉴别毒株毒力强弱的RT-PCR方法.引物P1+P2能特异性地对所有新城疫病毒可扩增出一条362bp的片段,引物P1+P3能特异性地针对所有新城疫强毒株扩增出一条254bp的片段,引物P1+P4能特异性地针对所有新城疫弱毒株扩增出一条254bp的片段,整个试验过程可在6小时内完成.对实验室分离的4株病毒进行检测,结果同常规检测方法的结果一致.     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因克隆及分子进化分析

用RT-PCR方法,以1株H2N2亚型禽流感病毒分离株RNA为模板,扩增了HA全基因cDNA.将HAcDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行了测序.测序结果表明所克隆的1685bp核苷酸片段包含了全部HA基因阅读框架和上下游引物,编码区为1683个核苷酸,编码560个氨基酸.将其序列与其他8株H9N2亚型禽流感病毒HA基因及推导的氨基酸序列进行比较,其核苷酸同源性在85.3%～98.6%之间,氨基酸同源性在88.8%～98.9%之间,HA基因裂解位点氨基酸序列没有连续碱性氨基酸插入.本研究结果为国内基因工程疫苗等研究奠定了基础,同时通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系.     

抗击“非典” 复星在行动

自“非典”在少数敏感地区出现后，复星就开始着手防非典药品的开发研制，在较短的时间内自主研究开发了SARS-CoV核酸扩增(RT-PCR)荧光检测试剂盒。该试剂盒采用巢式PCR技术，选取SARS病毒的特异片段为靶序列，具有灵敏度高，特异性能好，检测范围广等特点，尤其适用于感染后尚处于潜伏期病人的检测。     

点带石斑鱼神经坏死病毒基因组分析

[目的]准确诊断发生在福建南部点带石斑鱼育苗场的鱼病.[方法]根据基因库中已报告的石斑鱼NNV核苷酸序列,设计了8对特异性引物,用于扩增点带石斑鱼NNV的RNA1和RNA2特定片段.PCR扩增产物经琼脂糖电泳确认后进行核酸测序,用相应软件进行拼接,得到点带石斑鱼NNV基因组全序列.用DNAstar软件对该序列进行分析,得到相应的氨基酸序列.[结果]该病毒的RNA1含有一个编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase,RdRp)的开放阅读框(ORF)为2949nt,编码1个由982个氨基酸组成的蛋白质;RNA2的ORF为1017nt,编码1个由338个氨基酸组成的病毒主衣壳蛋白.将这些核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与基因库中同属于罗达病毒科(Nodaviridae)的其他罗达病毒进行同源性比较,该病毒与其他已知的石斑鱼NNV的同源性高.系统发育进化分析也表明,点带石斑鱼NNV与其他石斑鱼NNV亲缘关系很近,同属于赤点石斑NNV血清群,与其他β罗达病毒有一定的距离,与α罗达病毒则有明显的不同.[结论]福建南部个别点带石斑鱼育苗场的石斑鱼感染了神经坏死病毒.     

点带石斑鱼神经坏死病毒基因组分析

[目的]准确诊断发生在福建南部点带石斑鱼育苗场的鱼病.[方法]根据基因库中已报告的石斑鱼NNV核苷酸序列,设计了8对特异性引物,用于扩增点带石斑鱼NNV的RNA1和RNA2特定片段.PCR扩增产物经琼脂糖电泳确认后进行核酸测序,用相应软件进行拼接,得到点带石斑鱼NNV基因组全序列.用DNAstar软件对该序列进行分析,得到相应的氨基酸序列.[结果]该病毒的RNA1含有一个编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase,RdRp)的开放阅读框(ORF)为2949nt,编码1个由982个氨基酸组成的蛋白质;RNA2的ORF为1017nt,编码1个由338个氨基酸组成的病毒主衣壳蛋白.将这些核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与基因库中同属于罗达病毒科(Nodaviridae)的其他罗达病毒进行同源性比较,该病毒与其他已知的石斑鱼NNV的同源性高.系统发育进化分析也表明,点带石斑鱼NNV与其他石斑鱼NNV亲缘关系很近,同属于赤点石斑NNV血清群,与其他β罗达病毒有一定的距离,与α罗达病毒则有明显的不同.[结论]福建南部个别点带石斑鱼育苗场的石斑鱼感染了神经坏死病毒.     

应用RT—PCR检测灭活疫苗中口蹄疫病毒（核酸）

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测口蹄疫灭活疫苗中的病毒RNA.设计相应于病毒基因组VP1序列保守区段20mer长度的引物.分离出灭活疫苗水相,萃取总RNA,反转录合成cDNA,进行PCR扩增和电泳检测扩增产物,本引物对扩增片段长度483bp,并设计一个Marker作为对照.     

鹅细小病毒延边株VP3基因原核表达质粒构建

本试验根据GenBank已公布的鹅细小病毒B株基因序列,设计了一对扩增VP3基因的特异性引物,对鹅细小病毒延边分离株基因组DNA进行了PCR扩增,得到了约为1500bp的VP3基因片段,将其回收纯化后与pMD-18T simple载体连接,然后进行克隆,经双酶切分析、PCR鉴定及测序,验证了所克隆的基因是鹅细小病毒VP3基因.用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表达载体中,获得重组质粒PGEM-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析,证实了重组质拉的正确性.     

利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒

根据百合无症病毒(LSV)的核苷酸序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增得到了一条与目的片段大小一致的条带;进一步克隆测序表明,该序列与已知的LSV序列有96%的同源性.用随机引物法合成地高辛标记的cDNA探针,建立了核酸斑点杂交检测体系.本研究分别建立了用于LSV的特异性的高灵敏度RT-PCR检测体系(其检测灵敏度为1.4ng/叶片)和适合大通量检测的Dig-cDNA(地高辛标记)核酸斑点杂交检测体系(其检测灵敏度为20μg/叶片).     

多重PCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

建立快速检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR(MPCR)方法.针对古典型霍乱弧菌(CVC)和埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的共有序列霍乱肠毒素基因(ctxB)、CVC的毒力协调A亚单位基因(C-tcpA)、EVC的毒力协调A亚单位基因(E-tcpA)、副溶血性弧菌的热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列设计引物,建立多重PCR检测方法,相应扩增片段依次为564bp、617bp、471bp和202bp.用该方法检测EVC、CVC、副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、沙门氏菌等35株菌株表现出极好的特异性,对人工污染的罗非鱼、小虾、牡蛎、鱼鳃和鱼肠混合物的检出限EVC为2.2 cfu/mL、CVC为2.8 cfu/mL、副溶血性弧菌为6.5 cfu/mL,扩增片段表现出极好的特异性,整个实验过程8～10h完成.实验结果表明该方法是特异性强、省时、省力的检测方法.     

弓形虫半巢式PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因（X14080）设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504bp片段与P30基因（X14080）的序列同源性为99.8%。该PCR检测体系的特异性强,不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为18fg。     

微卫星标记位点的分离及其在美洲剑线虫群体分类鉴定上的应用

在美洲剑线虫群体(Xiphinema americanum group)上,应用简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应(DOPPCR)技术,克服了基因组DNA样本不足的难题,成功在微量基因组DNA条件下分离和标记了微卫星重复子(Microsatellite).研究中,目标DNA片段被克隆前,DOP-PCR产物首先被连接到载体上,然后通过寡核苷酸(CA)9和载体上游引物,对包含微卫星位点的左侧DNA片段进行PCR扩增,该过程后的产物用于克隆和DNA序列分析;依据已分析的部分左侧序列,设计引物并与载体下游引物一起,对DOP-PCR产物再进行PCR扩增,使包含整个微卫星及其右侧连接部分被扩增,重复克隆和DNA序列分析并结合已分析的左侧序列,获得了包含全部微卫星重复子的DNA片段的完整序列.这种分离含微卫星标记位点DNA片段的路径新颖、高效,有效克隆率提高到了93.3%.研究中,发现和分析了9个包含微卫星重复子的片段,美洲剑线虫(X.americanum sensu stricto)和美洲剑线虫亚群组(X.americanum subgroup)的标记性引物被设计和检测.     

食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法所用引物的特异性比较

[目的]对食品中单增李斯特氏菌PCR检测方法目前常用的引物进行特异性比较.[方法]用36株单增李斯特氏菌、非单增李斯特氏菌以及其他菌属的细菌,将我室的2对引物与其他作者设计的5对引物进行特异性比较.[结果]我室采用的引物FM1/FM2只对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段,引物LI1/U1只对所有李斯特氏菌属的细菌扩增出特异性片段.其他引物除了对单增李斯特氏菌扩增出特异性片段外,对其他细菌也会扩增出与特异性片段大小一致的片段.[结论]单增李斯特氏菌的特异引物FM1/FM2与李斯特氏菌属的特异引物U1/LI1组合应用,可以成为检测单增李斯特氏菌的最佳方法.     

五种马病毒基因芯片检测方法的建立

[目的]既保护我国畜牧业的安全,又在检验检疫口岸实现马匹的快速通关,探索建立马病毒基因芯片检测方法。[方法]采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒核酸序列、通过分子克隆技术获得西尼罗热、马冠状病毒、马鼻肺炎病毒和马动脉炎病毒的特异基因片段,设计合成五种马病病毒高度保守的特异性核酸序列作为检测探针点制于芯片上,再用多重不对称PCR以拼接、克隆的核酸序列为模板扩增目的片段,与芯片上探针特异结合。[结果]建立了五种病毒的基因芯片快速检测方法,实现了五种马病同时检测。[结论]本研究建立的芯片快速高通量基因芯片检测方法可应用于大规模出入境马属动物的快速筛查。     

用RT-PCR快速检测Taura综合症病毒

用RT-PCR快速检测南美白对虾中的Taura综合症病毒.引物TSVF和TSVR用于扩增病毒核酸中的231bp的片段.该方法能可靠地检测到患病的南美白对虾体内的Taura综合症病毒.     

猪流行性腹泻病毒套式RT—PCR检测方法的建立及初步应用

[目的] 建立PEDV的新型套式RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段.[方法] 根据Genbank已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的基因序列,设计合成两对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测PEDV的新型套式RT-PCR方法,并用该方法对PEDV进行了快速诊断和分析.[结果] 外引物扩增目的片段长度为1328bp,内引物扩增目的片段为540bp.[结论] 该套式RT-PCR方法比普通RT-PCR更加灵敏、可靠,可用于PEDV的快速诊断和流行病学调查.     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

设计合成2对PCV型特异性引物,其中C1、C2扩增PCV1和PCV2共有的938bp特异性片段,C3、C4只扩增PCV2特异性的490bp片段.在对该多重PCR的反应条件进行优化后,建立了猪圆环病毒多重PCR诊断方法,既可对PCV进行定性检测,又可对PCV1和PCV2进行定型,便于口岸检疫和养殖场的临床诊断.     

以oprI为靶基因实时荧光PCR法检测化妆品中绿脓杆菌

建立快速检测化妆品中绿脓杆菌的实时荧光PcR方法。选取绿脓杆菌oprI基因中相对保守且高度特异的核苷酸片段作为荧光PCR扩增的靶序列,设计引物和TaqMan探针,并研究了DNA提取方法,优化扩增反应体系和仪器条件。与GB方法进行比对,检测结果一致,但检测时间均只有GB方法的1／10;方法的检测灵敏度为2cFu／荧光PcR反应体系,染菌样品经6h增菌培养后,检测低限均达到2cFu／g,证明该方法高度敏感;通过对36株标准／参考菌株和51株非目的菌的检测,证实该方法高度特异;批内cP值的变异系数小于2％,说明该方法具有良好的可重复性。     

出入境人群艾滋病病毒env基因部分序列特征和亚型研究

[目的] 对出入境人员中的HIV感染者进行病毒基因型测定,监测国内外流行的HIV毒株的状况及其变化.[方法] 用RT-PCR或直接巢式PCR方法扩增HIV env基因C2-V3区及其邻近的基因片段,然后直接进行核苷酸序列测定,与国际标准亚型序列比较确定基因型并进行系统进化分析.[结果] 2003年确认的19例HIV阳性样品中有15例扩增出目的基因片段并进行了序列测定, 确定为B亚型4例、B'亚型2例、D亚型2例、CRF01-AE重组亚型1例、CRF02-AG重组亚型6例.这些不同亚型的HIV-1感染者来自包括中国在内的6个国家.HIV-1基因型的分布与我国国内有很大不同.[结论] 出入境人群中HIV-1基因种类多且复杂,监测出入境人群HIV基因型及其变化对于发现和鉴定新型变异毒株十分重要.