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通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(de-letingM),克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。 相似文献
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[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析。[方法]将WNV NS1基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pET30a-WNV-NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行SDS-PAGE和W estern-blot分析,经N i+亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作ELISA检测。将重组蛋白包板,检测FOCUS公司商品化试剂盒中的阳性血清。[结果](1)重组WNV NS1蛋白获得表达并纯化成功。(2)Western blot结果显示表达的蛋白是带有H is标签的目的蛋白。(3)兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1:50000以上。(4)检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2。[结论]重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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病毒分离结合荧光抗体技术与抗原捕获ELISA检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原的敏感性比较研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究通过体外增毒,再测定病毒的TCID50,然后将病毒培养物作系列稀释,比较了细胞传两代进行荧光抗体染色法与三种商品化的抗原捕获ELISA试剂盒(包括IDEXX公司生产的BVDV抗原检测试剂盒、POURQUIER生产的P80检测试剂盒及NSP2-3/E0检测试剂盒)检测病毒抗原的敏感性.结果表明,传两代进行荧光抗体染色的方法可检出10-6稀释的50μL细胞毒(0.12个TCID50),而三种商品化进口ELISA试剂盒分别只能达到10-2 (1.2×103个TCID50)和10-1 (1.2×104个TCID50)稀释的50μL细胞毒.尽管传两代进行荧光抗体染色的方法相对繁琐,但这种方法的敏感性是抗原捕获ELISA难以比拟的,因而更适合于血清中BVDV病毒抗原的检测. 相似文献
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旋毛虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用研究 总被引:1,自引:0,他引:1
根据旋毛虫隔离种线粒体Ls-rRNA基因序列,设计一对特异性引物及TaqMan MGB探针。以Ls-rRNA阳性重组质粒为模板,建立了旋毛虫实时荧光PCR检测方法。该检测方法对各旋毛虫隔离种具有良好的特异性,而对小鼠、狗和猪正常肌肉组织、猪鞭虫、猪蛔虫、猪钩虫、犬蛔虫等无交叉反应。最小检出量为1.32×10^2拷贝(10^-5条旋毛虫),建立的标准曲线拟合良好,扩增方程Y=-3.43X+19.70,相关系数R^2=0.9984,扩增效率为95%。平行检测组内变异系数为1.11%(n=20),同一组不同浓度梯度样本(n=9)间隔30d重复检测,结果无显著性差异。人工感染不同剂量猪旋毛虫的小鼠,在攻虫14d后检出率100%。对经压片镜检、人工胃液消化、胶体金试纸条检测结果为阴性的63份送检狗肉样本中敏感地检出8个阳性。 相似文献
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采用大肠杆菌表达的猪细小病毒非结构NS1蛋白为抗原,建立了PPV-NS1-ELISA.通过检测91份健康猪血清确定其阴、阳性界限为0.23,以传统的HI作标准,该方法有高特异性(100%)、高敏感性(88%)、高精确度(90%).批内、批间重复试验的变异系数均低于10%.该方法只与PPV感染猪的血清反应,与PPV灭活苗免疫猪的血清不反应,与猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、弓形虫(Toxoplasma)、衣原体(Chlamydia)、胸膜肺炎(APP)阳性血清无交叉反应.证明PPV-NS1-ELISA检测方法能够区分PPV感染猪和灭活苗免疫猪. 相似文献
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蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子”病病原鉴定中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患"红脖子"的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属. 相似文献