磺胺-5-甲氧嘧啶酶联免疫分析试剂盒的研制与应用

[目的]建立动物食品中残留磺胺-5-甲嘧啶的检测方法.[方法]用戊二醛法将磺胺-5-甲嘧啶(SMD)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白OVA)偶联.用紫外分光光度计进行扫描鉴定.以制备的SMD-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与骨髓细胞(SP2/0-Ag14)融合,制备腹水,获得高效价的抗体.[结果]建立了间接竞争ELISA的测定方法,检测限为1.766ng/mL,定量限为11.274ng/mL.用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原,做ELISA实验,结果显示抗体与这8种磺胺药没有交叉反应.制备了检测试剂盒,在肌肉、肝脏的样本中加入50ng/mL,100ng/mL做添加回收实验,回收率为87.45%～97.6%,变异系数为3.35%.[结论]本方法的检测限能够满足动物源性食品中SMD残留检测的要求,试剂盒灵敏度高,稳定性好,使用方便,适于基层大规模筛选.     

磺胺-5-甲氧嘧啶酶联免疫分析试剂盒的研制与应用

[目的]建立动物食品中残留磺胺-5-甲嘧啶的检测方法.[方法]用戊二醛法将磺胺-5-甲嘧啶(SMD)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白OVA)偶联.用紫外分光光度计进行扫描鉴定.以制备的SMD-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与骨髓细胞(SP2/0-Ag14)融合,制备腹水,获得高效价的抗体.[结果]建立了间接竞争ELISA的测定方法,检测限为1.766ng/mL,定量限为11.274ng/mL.用SD、SMM、SQ等8种药物作为竞争抗原,做ELISA实验,结果显示抗体与这8种磺胺药没有交叉反应.制备了检测试剂盒,在肌肉、肝脏的样本中加入50ng/mL,100ng/mL做添加回收实验,回收率为87.45%～97.6%,变异系数为3.35%.[结论]本方法的检测限能够满足动物源性食品中SMD残留检测的要求,试剂盒灵敏度高,稳定性好,使用方便,适于基层大规模筛选.     

高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中的盐酸克伦特罗

本实验采用高效液相色谱-串联质谱法对猪肉中的盐酸克伦特罗进行检测,在1~20 ng/mL范围内,色谱峰面积(y)与盐酸克伦特罗浓度(x)呈线性关系,检出限为0.33 ng/mL(信噪比为3)。线性回归方程y=1.114x-0.012,相关系数为0.999 5。由此可见,高效液相色谱-串联质谱法检测盐酸克伦特罗具有良好的分析性能。     

磺胺类药物的多残留酶联免疫法检测

本研究通过制备针对多种磺胺类药物具有敏感性的多克隆抗体(抗血清),建立快速ELISA检测方法,并初步应用于动物样品中药物残留的检测.以H1-HSA免疫动物获得的抗血清对磺胺药表现了较高的敏感性,且能识别氨苯磺胺及7种常用的磺胺药,其中的5种检测限低于最高残留限量100ng/mL;抗体与4种常用抗生素和3种结构类似物无交叉反应,具有较好的特异性;牛奶基质中药物的检测限均低于80ng/mL,鸡肌肉、肝脏样品中SMD的检测限均低于85ng/mL,基本上能满足磺胺类药物多残留免疫检测的要求.     

检测高效氯氟氰菊酯残留试剂盒的研制

利用化学合成对高效氯氟氰菊酯分子结构进行改造,制备了相应的半抗原,并与载体蛋白偶联合成人工抗原,免疫动物,制备单克隆抗体。在筛选高效氯氟氰菊酯单克隆抗体的基础上,建立酶联免疫检测方法,并研制出检测苹果、大豆、蔬菜中高效氯氟氰菊酯残留的试剂盒,蔬菜选择了莲花白作为检测对象。该试剂盒的灵敏度为1μg/L,对苹果、大豆、莲花白样本的最低检测限分别可达到20、30、60μg/kg;添加回收率68.8%~105.3%,批内变异系数为7.1%~13.2%;批间变异系数为7.9%~13.1%。对实际样本的检测结果与气相色谱法基本一致。该方法快速、灵敏、可靠,为水果、蔬菜中高效氯氟氰菊酯的残留检测提供了便捷、准确的分析检测手段。     

3种ELISA试剂盒对牛新孢子虫血清抗体比较检测

用瑞典Svanova公司、美国IDEXX公司和美国VMRD公司生产的3种检测新孢子虫血清抗体ELISA试剂盒对来自澳大利亚牛血清（41份）、新西兰牛血清（40份）、乌拉圭牛血清（30份）和中国新疆牛血清（46份）进行了同步检测和比较分析,并以其中2个试剂盒检测结果均为阳性或阴性的血清为真阳性或真阴性,对另1个试剂盒在诊断相对敏感性和相对特异性方面进行了比较评估。结果表明,3个试剂盒的诊断相对敏感性和诊断相对特异性分别为：85.7%和92.5%（Svanova）、95.8%和98%（IDEXX）、88.5%和98%（VMRD）。3个试剂盒都具有较好的重复性,检测低限相近。在对样品的检测中,IDEXX与VMRD两个试剂盒检测符合率较高,但对不同国家的样品检测符合率差别较大。     

快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断西尼罗病毒感染的胶体金免疫层析试纸条方法。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记西尼罗病毒NS1蛋白,采用双抗原夹心法制备胶体金免疫层析试纸条,对试纸条进行特异性和敏感性评价。[结果]该试纸条可在15min之内完成检测;在敏感性上,该试纸条对阳性血清的检测较美国Focus公司商品化的ELISA试剂盒检测低1个滴度;对89份阴性血清进行检测,试纸条检出9份阳性,ELISA试剂盒检出3份阳性,两种检测的符合率为86.52%,特异性为89.89%。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测西尼罗病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。     

检测莠去津残留试剂盒的研制

通过合成人工抗原、制备单克隆抗体,研制出检测玉米、甘蔗中莠去津残留的快速检测酶联免疫试剂盒。该试剂盒灵敏度为3μg/L,对玉米、甘蔗样本的最低检测限可达27μg/kg;该试剂盒添加回收率为88.5%~106.4%,变异系数为6.9%~8.8%;对实际样本的检测结果与气相色谱法基本一致。该方法快速、灵敏、可靠,为玉米、甘蔗中莠去津的残留检测提供了便捷、准确的分析检测手段。     

定量检测SARS-CoV N蛋白的悬浮芯片方法研究

利用悬浮芯片技术,建立定量检测SARS-CoV N蛋白的悬浮芯片方法。用抗体包被编码微球作为反应载体,双抗体夹心法为反应模式,建立了SARS冠状病毒悬浮芯片检测方法,通过盲样和实验室标准检测等评估,表明适用于现场样品的检测。检测SARS冠状病毒N蛋白的灵敏度为4.86 ng/mL,在4.86-25600 ng/mL浓度范围内具有良好的动力学响应特性,比ELISA方法有较高的灵敏度和较宽动态检测范围。在早期识别、快速诊断和应对生物恐怖威胁、传染病暴发中具有广阔的应用前景。     

酶联免疫法检测动物组织中磺胺嘧啶残留方法的建立

为了建立具有我国自主知识产权的快速检测农兽药残留的试剂以及相关的试剂盒,利用已有的科研资源,建立了快速检测磺胺嘧啶残留的酶联免疫检测法和试剂盒,其实验结果为除磺胺嘧啶外,与其他异构嘧啶类的交叉反应率约10%,与克伦特罗、氯霉素、四环素等其他药物无交叉反应,方法的特异性较好;方法的灵敏度为0.3ng/ml,定量直线范围为0.1-8.1ng/ml;样品经预处理,其检测时间约需5h;方法的回收率约60%以上;方法标准工作曲线的重复性试验的相关系数r2=0.92.同时,检测10份农兽药残留监控鸡肝样品,测定结果与理化方法HPLC结果有一定的趋同性.     

西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究

[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析。[方法]将WNV NS1基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pET30a-WNV-NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行SDS-PAGE和W estern-blot分析,经N i＋亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作ELISA检测。将重组蛋白包板,检测FOCUS公司商品化试剂盒中的阳性血清。[结果]（1）重组WNV NS1蛋白获得表达并纯化成功。（2）Western blot结果显示表达的蛋白是带有H is标签的目的蛋白。（3）兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1：50000以上。（4）检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2。[结论]重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础。     

自制麻痹性贝毒GTX2，3单克隆抗体在直接竞争酶免疫学检测方法中的初步应用

【目的】建立麻痹性贝类毒素GTX2,3直接竞争酶免疫学检测方法（de-ELISA）。【方法】通过过氧化反应将GTX2,3与辣根过氧化物酶HRP偶联,利用适当稀释的兔抗小鼠IgG多抗作为包被抗体,利用GTX2,3作为竞争剂与GTX2,3-HRP竞争结合自制GTX2,3的单克隆抗体,初步建立检测麻痹性贝类毒素GTK2,3的de-ELISA,并用直接竞争ELISA检测该方法与C2毒素之间的交叉反应。【结果】直接ELISA结果显示GTX2,3与HRP发生过氧化反应,de-ELISA检测麻痹性贝类毒素时,该方法的灵敏度为1μg／mL,工作范围为1-40μg／mL,该方法与C2毒素无交叉反应。【结论】初步建立的dc-ELISA适用于麻痹性贝类毒素的快速检测,为其酶免疫学快速检测试剂盒的研制奠定了基础。     

菜克多巴胺单克隆抗体的制备及竞争性ELISA检测方法的建立

本研究利用偶联的莱克多巴胺（Rac）作为免疫原,筛选出能稳定分泌针对莱克多巴胺的单克隆抗体的细胞株D1289,其分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类为IgCl,单抗腹水的效价不低于1：1×10^7,与Rac的类似物克伦特罗不发生交叉反应。在此基础上,利用获得的单抗研究建立Rac的竞争性酶联免疫吸附检测法（cELISA）,结果表明：所建立的间接竞争ELISA方法检测校准曲线的线性范围在0．01ng／mL-10ng／mL（RE=-0．9353）。     

盐酸克伦特罗胶体金快速检测试剂盒质量研究

选取3种市售同批次盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测试剂盒(D、M、A),引入金标读数仪,对其最小检出浓度、灵敏度、特异性、检出限、阳性检出率、假阳性率和假阴性率等方面进行研究,比较3种市售盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测试剂盒的质量。结果表明,D试剂盒中的检测卡在检测盐酸克伦特罗标准溶液时产品性能最优,M试剂盒的样品前处理方法和检测卡在猪肉基质中的综合使用效果最优。阴性猪肉加标样本的快速检测结果显示,试剂盒检测结果与金标读数仪器检测结果 100%符合,3种产品的最小检出浓度均小于产品说明书标注的检出限,且灵敏度100%,D、M特异性100%,D、M假阳性率0%,M阳性检出率100%,D、A阳性检出率均大于90%。综合分析,3种试剂盒的准确性、特异性等均较好,阳性检出率、假阴性率均在可接受范围内,其中,M试剂盒产品性能最优,可用于日常生猪屠宰点和农贸市场中猪肉盐酸克伦特罗的初筛。     

瘦肉精胶体金快速检测二联卡的研制

目的:研制用于现场检测肉制品中盐酸克伦特罗和沙丁胺醇(瘦肉精)的二联快速检测试纸条。方法:利用胶体金免疫层析技术,通过对标记抗体的pH、抗体浓度以及重悬液的条件优化进行二联卡的制备。结果:盐酸克伦特罗检出限为3 ng·mL~(-1),沙丁胺醇检出限达到5 ng·mL~(-1)。结论:瘦肉精快速检测二联卡灵敏度、特异性、稳定性、重复性都符合要求,可应用于肉制品和饲料样品的现场快速检测。     

病毒分离结合荧光抗体技术与抗原捕获ELISA检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原的敏感性比较研究

本研究通过体外增毒,再测定病毒的TCID50,然后将病毒培养物作系列稀释,比较了细胞传两代进行荧光抗体染色法与三种商品化的抗原捕获ELISA试剂盒(包括IDEXX公司生产的BVDV抗原检测试剂盒、POURQUIER生产的P80检测试剂盒及NSP2-3/E0检测试剂盒)检测病毒抗原的敏感性.结果表明,传两代进行荧光抗体染色的方法可检出10-6稀释的50μL细胞毒(0.12个TCID50),而三种商品化进口ELISA试剂盒分别只能达到10-2 (1.2×103个TCID50)和10-1 (1.2×104个TCID50)稀释的50μL细胞毒.尽管传两代进行荧光抗体染色的方法相对繁琐,但这种方法的敏感性是抗原捕获ELISA难以比拟的,因而更适合于血清中BVDV病毒抗原的检测.     

高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物

用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)同时测定动物肌肉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物.盐酸水解组织中蛋白结合代谢物,同时加入2-硝基苯甲醛(2-NBA),37℃过夜衍生.上清液调pH值7.0后,用Oasis HLB固相萃取(SPE)柱净化.采用电喷雾电离(ESI),正离子,选择反应监测(SRM)模式检测.三离子原则,外标法定量.定量限(LOQ)5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)均为0.1ng/g,氨基脲(SEM)、1-氨基-乙内酰脲(AHD)均为0.5nng/g;检测限(LOD)AMOZ、AOZ均为0.05ng/g,SEM、AHD均为0.1 ng/g.在添加浓度0.5～10ng/g范围内,AMOZ回收率为65.4%～91.3%,SEM回收率为62.7%～94.6%,AHD回收率为63.9%～89.4%,AOZ回收率为67.8%～90.9%.相对标准偏差(RSD)均小于4.8%.     

对牛奶中氯霉素的酶联免疫分析法检测

用ELISA法对鲜奶和全脂淡奶中的氯霉素进行检测,从精密度和回收率等方面来判断试剂盒的可行性.结果发现用于鲜奶检测时,添加水平为150ng/L时,平均回收率为84%;添加水平为1000ng/L时,平均回收率为84%.变异系数分别为19.2%和5.00%.全脂淡奶添加水平为150ng/L和1000ng/L时,平均回收率分别为50%～67%.在两种奶的检测方法中,鲜奶的回收率好于全脂淡奶.     

化妆品中苯甲酸、山梨酸和水杨酸的测定

使用Sinochrom C18柱做固定相,甲醇和0.02mol/L乙酸铵(1585)混合溶液做流动相,测定化妆品中的苯甲酸、山梨酸和水杨酸,方法无对羟基苯甲酸酯的干扰,三种组分可实现基线分离,回收率在92.20%～114.00%之间,变异系数小于5%.苯甲酸、山梨酸和水杨酸的最小检测量分别为10ng,0.4ng和10ng;最小检测浓度分别为0.5μg/mL,0.02μg/mL和0.5μg/mL.     

玉米褪绿斑驳病毒抗体及TAS-ELISA试剂盒的研制

将纯化的玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus）制剂免疫家兔,获得兔多克隆抗体;将纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术获得1株分泌玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体。研制了多克隆抗体为包被抗体,单克隆抗体为检测抗体的TAS-ELISA试剂盒。