荧光RT—PCR检测中强毒力新城疫病毒方法的敏感性和特异性

用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒方法检测10株不同稀释度的中强毒力新城疫病毒株感染尿囊液,并同时与鸡胚病毒分离比较表明,荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10-7,最低为10-5,略低于鸡胚病毒分离.对23株不同毒力的新城疫病毒用荧光RT-PCR进行了测定看出,本课题建立的荧光RT-PCR可以区分中强毒力新城疫病毒和疫苗弱毒.用建立的荧光RT-PCR检测中强毒力新城疫病毒株方法检测常见的禽类病毒,未发现交叉反应.     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的研究

鱼传染性造血器官坏死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus IHNV）、鱼病毒性出血性败血症病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus VHSV）和鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus SVCV）是同属弹状病毒科（Rhabdoviridae）的3种鱼类病毒,也是影响水产养殖业的3种重要病毒。通过对这3种病毒基因序列的分析,在病毒基因的高保守区域,设计了3条分别针对这3种病毒的Taqman MGB探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。以此为基础建立针对该3种病毒的三重实时荧光RT-PCR的检测方法。通过反应条件的优化,该三重实时荧光RT-PCR最低可检测至102拷贝/反应的病毒量。同时,该方法还对病毒混合感染EPC细胞（Epithelioma papulosum cyprini）和攻毒斑马鱼进行了检测。实验结果表明,该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法。     

实时荧光定量PCR法检测对虾白斑综合征病毒

对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）感染引起,所有养殖对虾对该病高度易感,蟹类、小龙虾、淡水虾以及各种龙虾也易感,但发病率和死亡率有很大差别。多种虾类常表现为持续感染或终身隐性感染。隐性感染虾体内的病毒含量极低,需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法。本文应用TaqMan探针技术设计了探针和引物,建立了检测WSSV的实时荧光定量PCR方法。对影响PCR反应的主要因素Mg^2＋浓度和退火温度等进行了优化,证明当Mg2＋浓度为3.5～4.0 mmol,退火温度为59～60℃时可获得最佳的扩增和检测效果。     

实时RT-LAMP与实时荧光RT-PCR检测贝类中GII型诺如病毒的研究

[目的]建立、评价GII型诺如病毒的一步法实时RT-LAMP快速检测方法。[方法]选取GII型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守基因序列设计RT-LAMP引物,经条件优化,分析该方法的检测灵敏性和特异性,并与实时荧光RT-PCR进行比较。[结果]GII型诺如病毒RT-LAMP的最佳反应条件是65℃,内外引物浓度比达1：10。该方法同其余常见食源性病毒没有交叉反应。对RNA参照品其检测低限可达10个RNA拷贝/反应,同实时荧光RT-P C R的检测水平相当;在人工感染的牡蛎和缢蛏中,RT-LAMP较实时荧光RT-P C R的检测灵敏度略低10倍。[结论]本研究所建立的RT-LAMP方法为GII型诺如病毒提供了一种灵敏、快速且简便的检测方法。     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系的方法

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Yvein necrosis strain,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本研究根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP）基因序列保守区域,设计合成了两对巢式PCR引物和一条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Real-time PCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Real time PCR等方法高。该方法检测灵敏度可达3 fg/μL植物总RNA。利用四对引物和一条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,检测的准确性比其它方法高。     

五种马病毒基因芯片检测方法的建立

[目的]既保护我国畜牧业的安全,又在检验检疫口岸实现马匹的快速通关,探索建立马病毒基因芯片检测方法。[方法]采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒核酸序列、通过分子克隆技术获得西尼罗热、马冠状病毒、马鼻肺炎病毒和马动脉炎病毒的特异基因片段,设计合成五种马病病毒高度保守的特异性核酸序列作为检测探针点制于芯片上,再用多重不对称PCR以拼接、克隆的核酸序列为模板扩增目的片段,与芯片上探针特异结合。[结果]建立了五种病毒的基因芯片快速检测方法,实现了五种马病同时检测。[结论]本研究建立的芯片快速高通量基因芯片检测方法可应用于大规模出入境马属动物的快速筛查。     

检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的正向基因芯片的制备

通过分析比较禽流感病毒H5、H7和H9亚型不同毒株的基因组序列,设计出H5、H7和H9亚型特异性引物与探针,将扩增产物点制在芯片上,分别用H5、H7和H9亚型特异性探针与芯片杂交,研制出用于禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测的正向杂交基因芯片,同时对正向基因芯片进行特异性、敏感性试验,并用该方法对待检样品进行了检测。结果表明,禽流感病毒正向基因芯片与新城疫病毒、传支病毒等6种禽类常见病毒无反应,其敏感性高于常规PCR方法。     

荧光RT—PCR检测活禽和禽组织中禽流感病毒的研究

本研究根据A型流感病毒的核酸保守区共有序列,开发、设计多条引物和探针序列,从中筛选敏感、特异的引物、探针,在循环参数、病毒核酸提取方法及逆转录条件优化的基础上,建立了快速的通用型"一步法"检测活禽或禽产品中所有A型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测技术.该方法敏感性高、特异性强,与国际标准方法--世界动物卫生组织(OIE)确定的鸡胚病毒分离相比,敏感性基本一致,可直接用来检测咽喉/泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒,将检测时间从原来最短所需要的21d缩短为4h.     

十二种食源性致病菌可见光基因芯片检测方法的建立

[目的]利用可见光基因芯片技术,针对12种常见食源性致病菌,建立快速、准确、高通量的诊断方法。[方法]设计靶细菌16S rDNA和23S rDNA的通用引物,反向引物5’端标记生物素;特异寡核苷酸探针设计在两对引物之间的可变区,5’端标记氨基基团。将探针点样于固相载体制备基因芯片,优化PCR反应体系后,PCR产物与芯片点制探针区域进行杂交,然后通过化学显色直接观察结果,并评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性等指标。收集临床样本28例,同时制备双盲模拟污染样本10例,对检测方法进一步评价。[结果]：本试验所建立的基因芯片方法可同时检测志贺菌、耶尔森氏菌、沙门菌、腊样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李氏菌、布鲁氏菌、变形杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7等12种食源性致病菌,特异性高,操作简便;针对纯培养食源性致病菌反应体系的灵敏度为10^3cfu/mL,模拟样本的灵敏度为10^4cfu/mL;重复性好;采用可见光基因芯片方法检测28例临床样本,26例与常规培养方法结果完全一致,符合率达到92.9%;双盲模拟样本的检测符合率达到100%。     

PCR技术在国内农产品及食品检测标准中的应用

随着PCR技术在农产品及食品检测方面的应用越来越广泛,其标准化程度也日益增加。本文综述了PCR技术在农产品食品致病菌检测、转基因成分检测、过敏源成分检测、病毒毒素检测等方面的贡献,旨在为PCR技术在多领域的发展提供新的思路。     

牛病毒性腹泻-粘膜病的检测技术研究进展

对牛病毒性腹泻-粘膜病的病毒分离、琼脂扩散试验、微量中和试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、核酸杂交技术、聚合酶链反应等检测技术进行了综述,对7种技术运用于牛病毒性腹泻-粘膜病的检测作了简要介绍,为进一步研究牛病毒性腹泻病毒提供参考。     

PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

基因芯片在犬病病原体检测中的应用

为了实现犬病的快速诊断,本研究利用高通量的基因芯片技术,建立了犬传染性肝炎、犬瘟热和犬细小病毒病基因芯片快速检测方法,同时提取DNA和RNA病毒核酸,再用多重不对称PCR扩增目的片段,与芯片上探针特异结合,实现了3种犬病同时检测,CDV、CAV的检测灵敏度达10^2copies,CPV的检测灵敏度达10^3copies。     

昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT—PCR检测方法的建立

[目的]建立昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法。[方法]利用Beacon Designer7．0软件设计引物,以人工合成昆津病毒巴马哈森林病毒E基因的片段作为模板,验证该方法的灵敏度及特异性。[结果]最低检出限：昆津病毒1．83106copies／μL,巴马哈森林病毒2．02×106copies／μL。[结论]建立的昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT-PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好等特点,适合于昆津病毒和巴马哈森林病毒的快速检测。     

7种甲型H1N1流感病毒核酸检测方法的比较和验证

[目的]比较和验证7种甲型H1N1流感病毒核酸检测方法,筛选出可用于实验室日常检测的方法,并证实实验室具有正确操作这些方法的能力。[方法]应用7种方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,包括5种SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法和2种Taqman探针荧光RT-PCR法的商业试剂盒,用于方法比较和验证的参考样品包括猪流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、能力验证样品等不同来源的核酸。[结果]2种预期用于猪流感H1N1病毒核酸检测的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法均能达到预期目的;3种预期用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸检测的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法均无法区分2009年新甲型H1N1流感病毒核酸和猪流感H1N1病毒核酸;2种Taqman探针荧光RT-PCR试剂盒均能正确检出2009年新甲型H1N1流感病毒核酸,但只有1种可检出能力验证阳性样品。[结论]5种SYBRGreen Ⅰ荧光RT-PCR法中有2种能用于猪流感H1N1病毒核酸的检测,另外3种不能用于新甲型H1N1流感病毒核酸的检测;2种Taqman探针荧光RT-PCR法的商业试剂盒能用于2009年新甲型H1N1流感病毒核酸的检测。