牛朊病毒正常蛋白特异性片段的克隆表达和纯化

[目的] 表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段.[方法] 用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达产物(包涵体)用8mol/L尿素溶解,在变性条件下用Cu2+氧化复性纯化.[结果] 重组表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,目的蛋白分子量约为15KD,Western blotting分析表明,目的蛋白具有朊病毒蛋白的抗原特性,变性条件下用Cu2+氧化复性纯化得到电泳纯的重组蛋白.[结论] 这一工作为下一步制备抗体和进行结构、功能的研究打下扎实基础.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.     

猪流行性腹泻病毒套式RT—PCR检测方法的建立及初步应用

[目的] 建立PEDV的新型套式RT-PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段.[方法] 根据Genbank已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的基因序列,设计合成两对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测PEDV的新型套式RT-PCR方法,并用该方法对PEDV进行了快速诊断和分析.[结果] 外引物扩增目的片段长度为1328bp,内引物扩增目的片段为540bp.[结论] 该套式RT-PCR方法比普通RT-PCR更加灵敏、可靠,可用于PEDV的快速诊断和流行病学调查.     

马冠状病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆及其表达

根据NCBI发表ECV核衣壳基因序列,用PCR方法扩增出ECV核衣壳基因片段,插入表达型载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-ECV-N.以IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE凝胶电泳分析,结果成功表达了42KD GST-ECV-N融合蛋白.将ECV-N从pGEX-ECV-N载体亚克隆到的杆状病毒转移载体pFastBac1,筛选出重组转移载体pFastBac-ECV-N,在DH1O细菌的转座子作用下,构建重组穿梭质粒Bacmid-ECV-N.提取正确重组的穿梭质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,结果获得了重组杆状病毒rBac-ECV-N.PCR和间接免疫荧光试验结果证明,ECV-N在Sf9细胞中得到了很好的表达.该结果对我国马群中冠状病毒感染的流行病学调查及深入研究有指导意义.     

西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究

[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析。[方法]将WNV NS1基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pET30a-WNV-NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行SDS-PAGE和W estern-blot分析,经N i＋亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作ELISA检测。将重组蛋白包板,检测FOCUS公司商品化试剂盒中的阳性血清。[结果]（1）重组WNV NS1蛋白获得表达并纯化成功。（2）Western blot结果显示表达的蛋白是带有H is标签的目的蛋白。（3）兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1：50000以上。（4）检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2。[结论]重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR鉴定简单异尖线虫方法的建立

根据GenBank发表的简单异尖线虫保守的ITS-2基因序列设计一对引物,用以扩增简单异尖线虫114 bp基因片段。用简单异尖线虫的重组质粒（AS-ITS-pGM）为模板建立SYBR Green I荧光定量PCR检测简单异尖线虫的方法,并用该方法对经PCR-RFLP鉴定为简单异尖线虫的样品进行鉴定。结果表明,本研究建立的简单异尖线虫SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高,稳定性好,可用于简单异尖线虫的鉴定。     

COⅠ和16S rDNA基因在台湾蠛蠓鉴定中的应用

本文对台湾蠛蠓(Lasiohelea taiwana)的COⅠ和16S rDNA基因序列进行了测定,并分析2个基因在台湾蠛蠓分子鉴定中的应用前景。结果表明,台湾蠛蠓COⅠ基因片段长度为709 bp,与台湾铗蠓(Forcipomyia taiwana)序列同源性最大(98%~99%),分子鉴定与传统形态学鉴定结果一致,而16S rDNA基因片段长度为542 bp,与库蠓属的Culicoides tuttifrutti较为相似(82%)。COⅠ基因还可用于蠓类不同属分类鉴定。因此,COⅠ和16S rDNA基因适用于蠓类的分子鉴定。     

蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子”病病原鉴定中的应用

在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患"红脖子"的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属.     

蛙病毒属PCR检测方法的建立及其在甲鱼“红脖子“病病原鉴定中的应用

在GenBank中搜寻EHNV相关序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)的检测方法,扩增蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)410 bp的DNA片段.用该方法从患“红脖子“的甲鱼中分离的病毒毒株(9701株)中扩增出特异性的片段.对扩增产物进行基因克隆、序列测定和序列分析,结果表明该片段和蛙病毒属其他病毒MCP的编码基因同源性都在96%以上,和牛蛙虹彩病毒的基因序列相似性为100%,因此初步判定9701株属于蛙病毒属.     

泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体构建

克隆人的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)基因,并为实现UFC1基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备做准备。方法:采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建并鉴定pGEX-4T-2-UFC1质粒。结果:双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pGEX-4T-2-UFC1重组载体。结论:成功构建泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体,为在原核系统中表达UFC1重组蛋白,并制备多克隆抗体奠定了基础,也为进一步研究UFC1基因功能提供了工具。     

牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

[目的]建立牛传染性鼻气管炎的PCR检测方法.[方法]根据牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化.[结果]得到与预期大小(362bp)一致的特异性片段.最佳退火温度为58～64℃,Mg2+最佳浓度为1.6mM,dNTPs为0.36mM,引物为0.2 pmol/μL,聚合酶0.8U/100μL.用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带.[结论]该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100μL,较其他方法敏感.     

产志贺毒素大肠杆菌的分子生物学检测方法研究

[目的]建立快速准确检测食品中产志贺毒素大肠杆菌的分子生物学方法.[方法]针对产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因,设计了4对特异性引物.[结果]采用多重PCR(multiplexPCR)方法,得到614bp、779bp、450bp和300bp 4条片断.[结论]实验结果表明,本文建立的mPCR方法较常规的大肠杆菌检测方法简便、快速、灵敏度高,灵敏度可达15cfu/mL.     

鹅细小病毒延边株VP3基因原核表达质粒构建

本试验根据GenBank已公布的鹅细小病毒B株基因序列,设计了一对扩增VP3基因的特异性引物,对鹅细小病毒延边分离株基因组DNA进行了PCR扩增,得到了约为1500bp的VP3基因片段,将其回收纯化后与pMD-18T simple载体连接,然后进行克隆,经双酶切分析、PCR鉴定及测序,验证了所克隆的基因是鹅细小病毒VP3基因.用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表达载体中,获得重组质粒PGEM-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析,证实了重组质拉的正确性.     

PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

稳定同位素质谱技术在区分不同奶源中的应用

牛奶是一种纯天然饮料,一直以来备受人们喜爱。牛奶可以强化骨骼,补充钙元素,提高机体免疫力。对于不同国家来说,牛奶分有不同的等级。为了提高和严格把控牛奶的质量,建立同位素质谱,同时测定牛奶中酪蛋白的δ~2H、δ~(13)C、δ~(15)N和δ~(34)S值。根据经过优化的等点沉淀法,在牛奶中提取高纯度蛋白质,利用纳升液相色谱-四级杆飞行时间质谱进一步分析提取的蛋白,并确认该蛋白为酪蛋白。根据EA-IRMS检测分离后的酪蛋白δ~2H、δ~(13)C、δ~(15)N和δ~(34)S值发现,δ~2H、δ~(13)C、δ~(15)N和δ~(34)S的值和牛奶的产地有一定关联。同一产地的牛奶中酪蛋白的δ~2H、δ~(13)C、δ~(15)N和δ~(34)S值分布范围一致,但不同产地的δ~2H、δ~(13)C、δ~(15)N和δ~(34)S值没有明显的相关性。利用这种方法可以有效简化前期的处理过程,且结果具有很好的重现性,方便进行检测,准确度高,能够用于调查市面上销售牛奶的原产地。     

鸡新城疫病毒强弱毒株RT—PCR鉴别诊断方法

本研究通过对不同毒力的新城疫病毒(NDV)的融合蛋白基因(F基因)核苷酸序列分析,根据毒力和序列间的相关规律,分别设计出3对引物P1+P2,P1+P3,P1+P4,建立了一种可以迅速鉴定新城疫病毒并且同时鉴别毒株毒力强弱的RT-PCR方法.引物P1+P2能特异性地对所有新城疫病毒可扩增出一条362bp的片段,引物P1+P3能特异性地针对所有新城疫强毒株扩增出一条254bp的片段,引物P1+P4能特异性地针对所有新城疫弱毒株扩增出一条254bp的片段,整个试验过程可在6小时内完成.对实验室分离的4株病毒进行检测,结果同常规检测方法的结果一致.     

一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限最低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。     

多重PCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

建立快速检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR(MPCR)方法.针对古典型霍乱弧菌(CVC)和埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的共有序列霍乱肠毒素基因(ctxB)、CVC的毒力协调A亚单位基因(C-tcpA)、EVC的毒力协调A亚单位基因(E-tcpA)、副溶血性弧菌的热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列设计引物,建立多重PCR检测方法,相应扩增片段依次为564bp、617bp、471bp和202bp.用该方法检测EVC、CVC、副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、沙门氏菌等35株菌株表现出极好的特异性,对人工污染的罗非鱼、小虾、牡蛎、鱼鳃和鱼肠混合物的检出限EVC为2.2 cfu/mL、CVC为2.8 cfu/mL、副溶血性弧菌为6.5 cfu/mL,扩增片段表现出极好的特异性,整个实验过程8～10h完成.实验结果表明该方法是特异性强、省时、省力的检测方法.     

口蹄疫病毒3AB基因的表达及活性分析

通过重叠PCR合成口蹄疫病毒3AB基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/3AB,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.重组蛋白主要以包涵体的形式表达,将包涵体洗涤溶解后,采用Na2 离子金属螯合亲和层析柱纯化,逐步透析法复性.ELISA实验表明,目的蛋白能与猪口蹄疫阳性血清发生特异性反应.本研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件.