PCR方法检测志贺氏菌的研究

建立一种快速检测志贺氏菌PCR检测方法.根据志贺氏菌的侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,设计引物,建立PCR检测方法.本方法特异性高,均能检测出志贺氏菌属的4个种,整个实验过程8～10h完成.建立的方法可用与实际检测中.     

应用荧光PCR方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌

[目的]发展一种快速、敏感、特异的荧光PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌.[方法]针对单增李斯特氏菌溶血素基因(hly A),设计特异的引物和TaqMan探针,优化体系,建立荧光PCR检测方法,对该方法的特异性和敏感性进行评价,并且在对188个进出口食品样本的检测中与传统方法进行对比.[结果]经对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株检测,结果显示该方法具有良好的特异性.灵敏度检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h.在实际样本的检测中,检测结果与传统方法结果一致.[结论]该方法能快速、简便和准确地检出单核细胞增生李斯氏菌,具有良好的应用前景.     

聚合酶链反应与自动荧光免疫酶标检测弯曲菌属的试验

弯曲菌属是一种引发人和动物食源性疾病的致病因子,涉及到食品的安全卫生.本文针对弯曲菌属的16sRNA建立快速检测鉴定弯曲菌属的PCR方法.并将其与自动酶联免疫荧光分析方法对原奶、水样、冻禽肉制品及宰前活禽的泄殖腔棉拭样品等多种样品进行检验,实验结果表明PCR扩增方法检测弯曲菌属具有灵敏、高效、特异、稳定的特点,与自动酶联免疫荧光分析方法有很好的互补性.     

黑麦草腥黑穗病菌的快速鉴定

从进境美国黑麦草种子中发现一种类似小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica)的冬孢子.选取小麦印度腥黑穗病菌的特异性引物Tin3/Tin4和黑麦草腥黑穗病菌(T.ualkeri)的特异性引物Tin11/Tin4以及两者的通用引物H4/H7、H11/H12对样品中的冬孢子进行套式PCR扩增,检出该批样品中含有黑麦草腥黑穗病菌(T.ualkeri).检测灵敏度为3个冬孢子,检测时间约为6h.与常规检测方法相比,工作效率至少提高了6倍.     

食品中单增李斯特菌快速、敏感、特异PCR检测方法的建立

[目的]建立食品中单增李斯特菌的PCR检测方法.[方法]根据单增李斯特菌的hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因各设计了一对引物,两对引物组合建立PCR方法,用人工污染食品对该方法进行验证,于37℃经24h预增菌和24h增菌后直接进行PCR分析.[结果]在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中单增李斯特菌的检出限为1cfu/25g(mL),在原奶和生肉中的检出限分别为1～10 cfu/25mL和25 cfu/25g.[结论]该方法快速、敏感、特异,适合不同类型食品的常规检测分析,可用于食品工业中单增李斯特菌的检测.     

空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR检测技术研究

空肠弯曲菌是世界卫生组织列为最常见食源性传染病菌之一的人兽共患病原菌,传统的分离鉴定方法需要耗费大量工时,并存在敏感性低、难以检出非可培养状态细菌和易出现假阴性结果等问题.本研究首创了空肠弯曲菌的磁捕获-荧光PCR快速检测方法,无需增菌培养即可直接捕获检样中的弯曲菌,利用实时荧光PCR进行鉴定,可在24h内完成检测,检测低限达到10cfu/mL,提高了非可培养状态空肠弯曲菌的检出率.     

奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研究

[目的] 建立和提出奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法.[方法] 利用细菌16S和23S rDNA的保守区作为通用引物,对6株阪崎肠杆菌16S～23S rDNA间区序列(ISR)进行了扩增和测序,在比较阪崎肠杆菌与其近源株16S1～23S rDNA间区序列的基础上,设计了11条阪崎肠杆菌PCR检测引物,组合成30对PCR引物并筛选出一对阪崎肠杆菌PCR检测的特异性引物,建立了奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法.[结果] 用10株阪崎肠杆菌,18株近源菌验证试验表明,本文所建立的PCR方法特异性强;加菌试验表明,奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为2.2～5.4cfu/100g,灵敏度高;新建的PCR方法与FDA BAM方法比较试验表明,两种方法的检测结果完全符合.[结论] 本文提出的奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法填补了国内空白,达到了国际先进水平,可在实际工作中推广.     

用FQ-PCR方法快速检测水产品中副溶血弧菌

[目的]采用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测与鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量检测试剂盒.[方法]根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线.以副溶血弧菌菌株8株及同源及非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测.同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测.[结果]该方法有良好的特异性8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其他24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,其它15株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.9871.直接进行定量检测,则检测低限在102cfu/g;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfu/g.[结论]该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景.     

利用PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌

本文介绍了一种快速检测食品中沙门氏菌的方法.操作步骤为,在缓冲蛋白胨水(BPW)中增菌18-24h,生理盐水洗菌2次后煮沸裂解细胞,以invA为目的基因进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测,两天时间即能得到明确结果.以全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉为实验对象,人为添加沙门氏菌,检测结果与传统培养方法和BAX(r)系统检测结果一致.实验检出限为100cfu/25g,准确性达100%.     

枸橼酸杆菌属的一个新种及其研究

从待出口冻兔肉中检出一株疑似枸橼酸杆菌新种的细菌,对其进行相关种属的鉴定研究,以确定该菌分类地位.采用伯杰氏系统细菌学手册细菌分类鉴定方法及分子生物学手段,对该菌进行培养特性、生化反应、血清凝集、噬菌体裂解、PCR鉴定和16SrRNA基因测序等研究.结果显示该菌与沙门氏菌O65诊断血清有单边交叉凝集,其O和H抗血清效价高,但与所有沙门氏菌代表株不凝集.噬菌体裂解试验证实该菌为枸橼酸杆菌,PCR阴性试验证实该菌非沙门氏菌.该菌生化反应符合枸橼酸杆菌属定义,但与已知¨种枸橼酸杆菌均有明显不同.同时,16S rRNA基因测序结果表明该菌与已知枸橼酸杆菌基因种(genomospecies)不同.所以,该菌为枸橼酸杆菌属的新种,暂名为滨州枸橼酸杆菌(Citrobacterbinzhou)简写为C.binzhou.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

食源性致病微生物中应用于PCR检测的靶基因

介绍了8种常见食源性微生物致病性大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌的PCR法检测中常用的靶基因,主要是一些编码特征毒素和其他的毒力因子的基因.     

利用IMS／PCR方法快速检测食品中单增李斯特菌

研究用免疫磁珠(1mmunomagnetic separation,IMS)和复合PCR(multiplex-PCR)联用方法,从样品中直接浓缩获取单增李斯特菌(Listeria monocytogenes).针对L.monocytogenes的Listeriolysin O基因和李斯特菌属的23S rRNA设计两对特异性引物,作为Polymerase Chain Reaction(PCR)的靶基因,经PCR反应分别得到700bp和240bp.用IMS/PCR方法和SN方法同时检测了样品162份,结果通过API方法确证,符合率达到100%.结果表明,本文建立的IMS/PCR方法较常规方法简便、快速、灵敏度高,灵敏度可达1.5CFU/mL,在24h可快速检出L.monocytogenes,有很好的应用前景和研究价值.     

单增李斯特菌选择性增菌培养和分离方法的比较研究

首先对改良的FDA法、NGFIS法、SN法和国标法4种李斯特菌选择性增菌和分离方法进行比较,结果表明对于人工污染的样品(生猪肉、虾、牛奶),各种增菌方法的检测灵敏度都较高,均能检出样品中<10CFU/g的单增李斯特菌;但对于不同自然样品(生猪肉、调理食品、虾和牛奶)的李斯特菌检出,则以改良的FDA法最佳.本项目设计了英诺克李斯特菌和单增李斯特菌的竞争性试验,明确当样品中含有英诺克李斯特菌时,增菌时间应缩短.     

矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力验证结果评价

目的:通过对矿泉水中铜绿假单胞菌的检测能力验证计划[ACAS-PT551(2018)],确保南平市食品药品检验检测中心微生物实验室具备检验该菌的能力,出具公平公正、合法有效的检验检测报告。方法:依据能力验证参试指导书,利用实时荧光定量PCR法进行快速筛查,同时按国家标准GB 8538-2016法对两个盲样进行检测。结果:两种方法皆显示这两个盲样中存在铜绿假单胞菌,样品18-U262报出值为4600CFU/250mL,样品18-N396报出值为2 200 CFU/250 mL。结论:本次试验Z值分别为0.3和0.5,|Z|均小于2,评价结果满意,说明本实验室具备检验该菌的能力;同时两种方法结果一致,说明实时荧光定量PCR法可辅助国标法进行快速筛查,提高检测效率。     

十二种食源性致病菌可见光基因芯片检测方法的建立

[目的]利用可见光基因芯片技术,针对12种常见食源性致病菌,建立快速、准确、高通量的诊断方法。[方法]设计靶细菌16S rDNA和23S rDNA的通用引物,反向引物5’端标记生物素;特异寡核苷酸探针设计在两对引物之间的可变区,5’端标记氨基基团。将探针点样于固相载体制备基因芯片,优化PCR反应体系后,PCR产物与芯片点制探针区域进行杂交,然后通过化学显色直接观察结果,并评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性等指标。收集临床样本28例,同时制备双盲模拟污染样本10例,对检测方法进一步评价。[结果]：本试验所建立的基因芯片方法可同时检测志贺菌、耶尔森氏菌、沙门菌、腊样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李氏菌、布鲁氏菌、变形杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7等12种食源性致病菌,特异性高,操作简便;针对纯培养食源性致病菌反应体系的灵敏度为10^3cfu/mL,模拟样本的灵敏度为10^4cfu/mL;重复性好;采用可见光基因芯片方法检测28例临床样本,26例与常规培养方法结果完全一致,符合率达到92.9%;双盲模拟样本的检测符合率达到100%。     

巢式-多重RT-Realtime PCR检测马铃薯黑环斑病毒的研究

马铃薯黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）是马铃薯重要病毒病害之一。本研究根据PBRSV基因组中RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）保守序列,设计合成了两对巢式PCR引物和1条Taq-MAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Realtime PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM试剂盒快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达450fg/μL植物总RNA。利用4对引物和1条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。     

PMA—PCR技术在植物病原细菌检疫中的应用前景

介绍了PMA-PCR技术检测活菌的方法,列举了该方法在食品、医疗和环境微生物检测领域的应用研究情况,并讨论了PMA．PCR技术在植物病原细菌检疫工作中的应用前景。     

荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS

根据转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)基因序列,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针,建立一种应用荧光双链探针的实时PCR定量检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测,发现11份样品中有5份检出35S和NOS基因成分,其余6份样品结果为阴性.结果表明本文建立的荧光PCR方法能有效检测出35S和NOS两种转基因成分,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。