鹅细小病毒延边株VP3基因原核表达质粒构建

本试验根据GenBank已公布的鹅细小病毒B株基因序列,设计了一对扩增VP3基因的特异性引物,对鹅细小病毒延边分离株基因组DNA进行了PCR扩增,得到了约为1500bp的VP3基因片段,将其回收纯化后与pMD-18T simple载体连接,然后进行克隆,经双酶切分析、PCR鉴定及测序,验证了所克隆的基因是鹅细小病毒VP3基因.用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表达载体中,获得重组质粒PGEM-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析,证实了重组质拉的正确性.     

PRRSV SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（de-letingM）,克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组M蛋白。以纯化的重组M蛋白作为抗原,建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立ELISA最佳工作条件。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验验证,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;与美国IDEXX公司试剂盒相比较,特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,无显著性差异。用建立的方法检测临床血清样品168份,总阳性率为39.9%。     

海洋放线菌铁蛋白的克隆

本文利用PCR技术,以海洋放线菌为DNA的模板,克隆出铁蛋白的目的基因片段,然后进行酶切,再与载体p UC18结合构建重组质粒,转移到大肠杆菌中,然后提取质粒,通过酶切验证和测序验证重组质粒是否正确。该基因的克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

马冠状病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆及其表达

根据NCBI发表ECV核衣壳基因序列,用PCR方法扩增出ECV核衣壳基因片段,插入表达型载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-ECV-N.以IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE凝胶电泳分析,结果成功表达了42KD GST-ECV-N融合蛋白.将ECV-N从pGEX-ECV-N载体亚克隆到的杆状病毒转移载体pFastBac1,筛选出重组转移载体pFastBac-ECV-N,在DH1O细菌的转座子作用下,构建重组穿梭质粒Bacmid-ECV-N.提取正确重组的穿梭质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,结果获得了重组杆状病毒rBac-ECV-N.PCR和间接免疫荧光试验结果证明,ECV-N在Sf9细胞中得到了很好的表达.该结果对我国马群中冠状病毒感染的流行病学调查及深入研究有指导意义.     

口蹄疫病毒3AB基因的表达及活性分析

通过重叠PCR合成口蹄疫病毒3AB基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/3AB,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.重组蛋白主要以包涵体的形式表达,将包涵体洗涤溶解后,采用Na2 离子金属螯合亲和层析柱纯化,逐步透析法复性.ELISA实验表明,目的蛋白能与猪口蹄疫阳性血清发生特异性反应.本研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件.     

海洋放线菌酰胺酶AM合成基因的克隆

克隆稀有海洋放线菌酰胺酶AM合成基因的基因片段。根据Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守区设计两对酰胺酶特异性引物,以其总DNA为模板,采用PCR的方法扩增得到了包含酰胺酶AM的完整的基因片段,并将该片段成功插入克隆载体pUC-18中。将重组质粒进行酶切验证,并在检测机构中验证测序结果正确,成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的酰胺酶AM合成基因的基因片段。     

双表达系统制备新型冠状病毒N基因装甲RNA颗粒的研究

人工合成新型冠状病毒(SARS-CoV-2)标准参考毒株Wuhan/WIV04/2019完整N基因序列(1260 bp)和包含MS2噬菌体基因组成熟酶蛋白、衣壳蛋白基因序列(1682 bp),分别克隆到原核双表达质粒pACYCDuet-1的2个不同的多克隆位点,从而获得重组表达质粒pACYC-MS2-CoV2 N.将p...     

口蹄疫病毒3AB克隆表达及其抗体间接ELISA检测方法建立与应用研究

采用重叠PCR方法人工合成3AB基因片段,将其克隆到PET-28a＋载体,转化导入宿主菌BL21（DE3）中成功表达,获得大小约为33Ku的重组表达蛋白。以纯化的重组表达蛋白为抗原,建立了检测猪FMDV3ABNSP抗体的间接ELISA方法。将本方法与进口口蹄疫非结构蛋白3ABC阻断ELISA试剂盒进行比较,结果显示,本方法可以用于区分猪口蹄疫自然感染动物与疫苗免疫动物。     

Lea14基因原核表达载体的构建

Lea基因编码的LEA蛋白作为一种晚期胚胎丰富脱水保护蛋白，当植物处于逆境状态下时，其能够高水平的表达，通过降低其脱水的程度来达到抵御逆境的功能。为了进一步研究Lea14基因在逆境反应中的功能，本研究以拟南芥cDNA为模板，扩增出Lea14基因，再将Lea14基因克隆到原核表达载体pET-28a中，获得了Lea14基因的原核表达载体pET-28a-Lea14，测序结果表明：pET-28a-Lea14载体构建成功，可用于后续蛋白表达研究工作。     

耐热β-葡萄糖苷酶固定化研究

本文借助原核表达系统,成功制备了耐热β-葡萄糖苷酶,酶活性可达0.745 k,以经戊二醛交联的DEAE纤维素作为载体固定化耐热β-葡萄糖苷酶,并优化固定化条件,结果显示戊二醛浓度为4%,加酶量为0.5 mL时,固定化效果最好,经测定,固定化酶的酶活回收率可达到84.6%,且载体材料耐高温。本研究实现了经济、安全、高效的耐热β-葡萄糖苷酶制备方法,以及耐热β-葡萄糖苷酶的固定化条件优化,为探索适合商业化生产京尼平的制备技术提供有力的数据支撑。     

牛朊病毒正常蛋白特异性片段的克隆表达和纯化

[目的] 表达重组牛朊病毒正常蛋白特异性片段.[方法] 用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因,利用DNA重组技术,将牛朊病毒正常蛋白特异性片段基因插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,将表达产物(包涵体)用8mol/L尿素溶解,在变性条件下用Cu2+氧化复性纯化.[结果] 重组表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,目的蛋白分子量约为15KD,Western blotting分析表明,目的蛋白具有朊病毒蛋白的抗原特性,变性条件下用Cu2+氧化复性纯化得到电泳纯的重组蛋白.[结论] 这一工作为下一步制备抗体和进行结构、功能的研究打下扎实基础.     

海洋生物岩沙海葵毒素血清免疫抗体的制备

[目的] 为建立岩沙海葵毒素(PTX)的酶联免疫快速测试方法提供特异性免疫抗体.[方法] 巯基化标准PTX成半抗原PTX-PDP;巯基化匙眼血蓝蛋白(KLH)成KLH-SH,两者合成反应人工抗原PTX-PDP-KLH.用PTX-PDP-KLH免疫雌性6～8周龄Balb/c小鼠,制备PTX多克隆抗体.用同样方法制备包被抗原PTX-PDP-BSA,用以检测血清抗体效价.[结果] 紫外检测标准品PTX的最大吸收波长在264nm处,纯品KLH及BSA的最大吸收波长在278nm及279nm处,小鼠血清多克隆抗体PTX-PDP-KLH和PTX-PDP-BSA的最大吸收波长分别在267nm和273nm处.抗血清效价达到13200 ,与正常Balb/c小鼠、昆明小鼠及兔血清间无交叉反应.[结论] 合成的PTX人工抗原纯度高,成功制备PTX多克隆抗体血清.     

对虾白斑综合征病毒表面抗原基因免疫保护性的研究

将对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,W SSV）的VP19、VP28基因融合克隆入pVAX1.0真核表达载体制备成多价 DNA 疫苗,并用构建的 DNA 疫苗制备成饲料免疫实验对虾,用RT-PCR 检测DNA 疫苗在对虾体内的表达,同时比较构建的多价DNA 疫苗与VP19、VP28单价DNA 疫苗对抗W SSV的保护率。结果显示构建的DNA疫苗有抗W SSV免疫保护性,且pVAX1.0-VP19-VP28多价DNA 疫苗保护率高于单价疫苗。     

弓形虫P30基因的克隆及其在E．coli中的融合表达

【目的】研究弓形虫P30基因的克隆及其在E．coli中的融合表达。【方法】参照弓形虫P30序列设计引物,应用PCR技术扩增出弓形虫RH株P30的部分基因,将扩增产物克隆到pUCm—T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET-30a中,得到重组质粒pET-30a—P30并将其转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Westen-blot分析。【结果】P30基因在E．coli中得到了高效表达,表达的融合蛋白的分子量在30kDa附近,可以被鼠抗Toxoplasma gondii阳性血清特异性识别。【结论】该研究为Toxoplasma gondii的检测和疫苗研制及综合防制奠定了基础。     

岩沙海葵毒素直接酶联免疫吸附检测方法的研究

[目的]制备岩沙海葵毒素(PTX)多抗血清,纯化并标记辣根过氧化物酶,建立PTX多克隆直接酶联免疫吸附检测方法.[方法]将纯品毒素PTX与大分子蛋白质匙眼血蓝蛋白(KLH)分别巯基化,用化学法偶联二者成为半抗原,以其诱导BALB/c小鼠产生多价抗血清;以辣根过氧化物酶(HRP)标记PTX多抗血清;以PTX纯毒素作为包被抗原,HRP标记的多价抗血清为酶标抗体,建立PTX多抗直接ELISA检测方法.[结果]制备的抗PTX多价抗血清,经纯化后与HRP标记成功;建立的PTX多抗直接ELISA检测法,其最佳工作浓度为180.[结论]本研究制备的PTX人工免疫抗原具有较高的特异性和免疫原性,多克隆抗体为特异性抗PTX抗体,PTX多抗直接ELISA检测法对PTX的检测可达到5～10ug水平,该法应用于海产品中PTX快速检测的结果,待进一步研究.     

玉米褪绿斑驳病毒抗体及TAS-ELISA试剂盒的研制

将纯化的玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus）制剂免疫家兔,获得兔多克隆抗体;将纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术获得1株分泌玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体。研制了多克隆抗体为包被抗体,单克隆抗体为检测抗体的TAS-ELISA试剂盒。     

西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究

[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析。[方法]将WNV NS1基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pET30a-WNV-NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行SDS-PAGE和W estern-blot分析,经N i＋亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作ELISA检测。将重组蛋白包板,检测FOCUS公司商品化试剂盒中的阳性血清。[结果]（1）重组WNV NS1蛋白获得表达并纯化成功。（2）Western blot结果显示表达的蛋白是带有H is标签的目的蛋白。（3）兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1：50000以上。（4）检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2。[结论]重组NS1蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究NS1蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础。     

出入境人群艾滋病病毒env基因部分序列特征和亚型研究

[目的] 对出入境人员中的HIV感染者进行病毒基因型测定,监测国内外流行的HIV毒株的状况及其变化.[方法] 用RT-PCR或直接巢式PCR方法扩增HIV env基因C2-V3区及其邻近的基因片段,然后直接进行核苷酸序列测定,与国际标准亚型序列比较确定基因型并进行系统进化分析.[结果] 2003年确认的19例HIV阳性样品中有15例扩增出目的基因片段并进行了序列测定, 确定为B亚型4例、B'亚型2例、D亚型2例、CRF01-AE重组亚型1例、CRF02-AG重组亚型6例.这些不同亚型的HIV-1感染者来自包括中国在内的6个国家.HIV-1基因型的分布与我国国内有很大不同.[结论] 出入境人群中HIV-1基因种类多且复杂,监测出入境人群HIV基因型及其变化对于发现和鉴定新型变异毒株十分重要.     

米曲霉酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)的克隆

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)通过参与酰基辅酶A的代谢和参与脂肪酸的代谢过程,进而影响酱油的风味物质——酯的代谢。本实验从培养不同时段的米曲霉A100-8中提取总m RNA,通过逆转录和PCR技术扩增酰基辅酶A结合蛋白基因(ACBP)。经过连接、转化和蓝白斑筛选以及双酶切验证,最后进行测序,结果正配率达到99%,为研究和改良酱油的风味物质提供了分子理论基础。     

弓形虫半巢式PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因（X14080）设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PCR检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序。结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504bp片段与P30基因（X14080）的序列同源性为99.8%。该PCR检测体系的特异性强,不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为18fg。