用FQ-PCR方法快速检测水产品中副溶血弧菌

[目的]采用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测与鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量检测试剂盒.[方法]根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线.以副溶血弧菌菌株8株及同源及非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测.同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测.[结果]该方法有良好的特异性8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其他24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,其它15株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.9871.直接进行定量检测,则检测低限在102cfu/g;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfu/g.[结论]该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景.     

针对hly基因快速筛检食品中霍乱弧菌实时荧光PCR方法的研究

[目的]研制一种供基层疾病控制和口岸检疫单位日常疫情监测使用的对水产品、食品、外环境水中的O1群、O139群和非O1群、非O139群霍乱弧菌都可进行筛检的实时荧光PCR快速检测方法及其通用试剂体系.以早期进行流行株的鉴定,分析外环境疫情变化.[方法]针对霍乱弧菌溶血素基因(hly)设计引物和探针,取标准O1、O139、非O1非O139群霍乱菌种各10株,其他肠道菌种21株同时做荧光PCR测试其特异性;用标准菌株系列稀释敏感度测试、实际样品稀释染菌敏感度测试、实际样品不经增菌直接检测低限实验、实际样品经过夜培养增菌检测低限实验等测试其敏感性;通过日常实际样品对方法的应用和实验室间验证考察其符合性.[结果]实验与对照菌株51株只有霍乱弧菌产生S型扩增荧光曲线,其它同源和非同源菌株均未产生S型荧光扩增曲线,设计的引物探针具有强特异性;通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系直接检测染菌样本的检测低限为103cfu/mL;对染菌样本经过夜培养增菌检测低限分别在霍乱弧菌O1群为2.1cfu/g、霍乱弧菌O139群为1.4cfu/g、霍乱弧菌非O1非O139群为3.4cfu/g;实际样本检测252例阳性检出情况与常规方法一致.实验室间验证结果同实验一致.[结论]研制的通用霍乱弧菌实时荧光PCR试剂体系具有快速、准确、实用、敏感性强的优点,值得在各检测部门推广应用.     

环己酮七叶苷-β－Ｄ葡萄糖苷的研制及效果评价

[目的]研制李斯特菌显色培养基.[方法]合成环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷(CHE-β-D-葡萄糖苷).通过22种菌对其检测效果进行验证.[结果]环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷与七叶苷具有相同的检出效能;但其显色效果优于七叶苷,在环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷琼脂培养基上,被分解的游离环己酮七叶苷不扩散,固定在细菌菌落上,形成黑色菌落,从而有利于准确地鉴别和计数.与此相反,七叶苷琼脂上的阳性菌落,其分解产生的黑色素向周围培养基扩散,难以分辨阳性和阴性菌落,影响鉴别和计数的准确性.[结论]与传统七叶苷显色培养基相比,环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷显色培养基对分离和鉴定细菌存在很大优越性.     

环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷的研制及效果评价

[目的]研制李斯特菌显色培养基.[方法]合成环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷(CHE-β-D-葡萄糖苷).通过22种菌对其检测效果进行验证.[结果]环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷与七叶苷具有相同的检出效能;但其显色效果优于七叶苷,在环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷琼脂培养基上,被分解的游离环己酮七叶苷不扩散,固定在细菌菌落上,形成黑色菌落,从而有利于准确地鉴别和计数.与此相反,七叶苷琼脂上的阳性菌落,其分解产生的黑色素向周围培养基扩散,难以分辨阳性和阴性菌落,影响鉴别和计数的准确性.[结论]与传统七叶苷显色培养基相比,环己酮七叶苷-β-D-葡萄糖苷显色培养基对分离和鉴定细菌存在很大优越性.     

多重PCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

建立快速检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR(MPCR)方法.针对古典型霍乱弧菌(CVC)和埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的共有序列霍乱肠毒素基因(ctxB)、CVC的毒力协调A亚单位基因(C-tcpA)、EVC的毒力协调A亚单位基因(E-tcpA)、副溶血性弧菌的热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列设计引物,建立多重PCR检测方法,相应扩增片段依次为564bp、617bp、471bp和202bp.用该方法检测EVC、CVC、副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、沙门氏菌等35株菌株表现出极好的特异性,对人工污染的罗非鱼、小虾、牡蛎、鱼鳃和鱼肠混合物的检出限EVC为2.2 cfu/mL、CVC为2.8 cfu/mL、副溶血性弧菌为6.5 cfu/mL,扩增片段表现出极好的特异性,整个实验过程8～10h完成.实验结果表明该方法是特异性强、省时、省力的检测方法.     

显色培养基分离婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的效果比对和应用

分析广东环凯公司阪崎肠杆菌显色培养基(CRM006)和科玛嘉阪崎肠杆菌显色培养基(DFI)的实验应用效果,为检测婴幼儿乳粉中的阪崎肠杆菌选用培养基提供依据。按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验》(GB/T 4789.40-2010)分离及生化鉴定阪崎肠杆菌,并分析培养基的分离效果。结果表明,36份样品中,检出阪崎肠杆菌2份,检出率为5.56%;CRM平板和DFI平板阳性符合率为100%;疑似菌落检出率分别为16.67%和13.89%(P0.05)。CRM平板和DFI平板用于培养分离阪崎肠杆菌均有良好效果。     

4种食品中大肠杆菌检测方法评价

[目的]探求快速、灵敏、可靠的检测食品中大肠杆菌的方法。[方法]通过选择性鉴定试验、敏感性试验及其在食品检测中的应用效果对大肠杆菌的4种检测方法：GB/T4789.38-2008第一法、SN/T1896-2007第二法、GB/T4789.38-2008第三法与COLI ID显色培养基法进行比较研究。[结果]4种方法检测对大肠杆菌选择性良好,SN/T1896-2007第二法敏感性较GB/T4789.38-2008第一法稍高,GB/T4789.38-2008第三法与COLI ID显色培养基法敏感性相差不大;4种方法应用在食品检测中,大肠杆菌阳性检出率无显著差异。[结论]SN/T1896-2007第二法、GB/T4789.38-2008第三法与COLI ID显色培养基法耗费比GB/T4789.38-2008第一法高,但检测周期短,可节省人力,具有快速、方便的优点,在日常检测中值得推广应用。     

检测单增李斯特氏菌的几种选择性固体培养基的效果比较

[目的]选择更加适合单增李斯特氏菌检测的固体选择性培养基.[方法]参见ISO/TS11133-2中的培养基验证方法并有所改进,对国际上常用的3种选择性固体培养基进行比较选择.[结果]OXA和李斯特氏;显色培养基的增菌效果相近,且单增李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌在李斯特氏菌显色培养基上具有特征性菌落形态,易于与其他李斯特氏菌相区别.[结论]OXA和李斯特氏菌显色培养基效果较好,比较适合单增李斯特氏菌的检测,两种培养基联合使用可以提高单增李斯特氏菌的检出率.     

冷冻饮品国家卫生标准中大肠菌群限值的探讨

目的:对冷冻饮品卫生标准GB 2759-2015微生物学大肠菌群限值进行探讨。方法:采用MPN及平板计数法检测样品1和样品2中的大肠菌群,采用MPN计数法检测样品2中的粪大肠菌群。结果:样品1大肠菌群MPN计数合格率为13.3%,平板计数合格率为93.9%;样品2大肠菌群平板计数合格率为100%,MPN计数法均检出大肠菌群,粪大肠菌群检出率为93.3%。结论:冷冻饮品大肠菌群的检验方法可根据污染情况选择MPN及平板计数法,并增加粪大肠菌群检验项目。     

荧光分析法快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的] 提出一种新颖、简便、快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法.[方法] 本方法用阿拉伯糖-葡萄糖醛酸盐培养基(AG)在37℃下对副溶血性弧菌进行增菌,以苯甲基-L-精氨酸-7-氨甲基-香豆素(Bz-Arg-7AMC)作荧光底物,用荧光分析法检测该菌的胰蛋白酶样活性,通过判读胰蛋白酶样活性,确定水产品中是否污染有副溶血性弧菌.[结果] 该方法的灵敏度为20个/g,相关分析表明荧光分析法与5管MPN计数法呈正相关,相关系数为0.86.[结论] 用本方法只需8个小时就可完成水产品中的副溶血性弧菌的检验,操作简便,灵敏度较高,适于快速检测需要.     

副溶血性弧菌REP-PCR分型研究

[目的]了解食品中分离的副溶血性弧菌REP-PCR分子型别,探讨DiversiLab系统对副溶血性弧菌的分型能力。[方法]采用以REP-PCR为原理的DiversiLab系统对食品中分离的21株副溶血性弧菌进行分子分型,分析菌株之间的相关性,并与PFGE分型结果比较。[结果]DiversiLab将21株副溶血性弧菌分成16个群,菌株之间的相似度64.5%-99.1%,分离自相同食品中的副溶血性弧菌在REP-PCR聚类图中分在同一个群;7株副溶血性弧菌PFGE分型结果产生7种不同的PFGE型别,菌株之间不相关,在REP-PCR聚类图中分在7个不同的群中。[结论]食品中分离的副溶血性弧菌REP-PCR型别分散,未表现出地区特异性;DiversiLab简便、快速、分辨率高,可应用于副溶血性弧菌的快速分型和溯源。     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

目的:弗尼斯弧菌(Vibrio fumissii)是引起世界范围内胃肠功能紊乱的致病菌之一,一般通过摄人生的或者未煮熟的水产品进行传播。本研究旨在建立高效、可靠的PCR检测方法应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。方法和结果:根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计普通PCR引物及实时PCR引物、探针,建立普通PCR和实时荧光PCR方法,分别对两种方法的特异性和灵敏度进行比较分析,同时应用于384份食品样品检测。结果表明,建立的普通PCR和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为:2.4×10^3 CFU/ml和24 CFU/ml,并于5 h内完成整个检测过程,同时对384份食品进行检测,共检出6株阳性菌株。结论:本研究建立的PCR检测技术灵敏度高、特异性好,可应用于食品中弗尼斯弧菌的快速检测。     

犬钩端螺旋体PCR检测方法的应用

采用荷兰皇家热带病研究院WHO钩体病参考中心设计的一对引物进行普通PCR检测。经反应条件与体系优化,对犬钩端螺旋体与霍乱弧菌,伤寒杆菌,沙门氏菌,产毒性大肠杆菌,致病性大肠杆菌,痢疾,溶藻菌,非O1、O139霍乱弧菌,副溶血性弧菌,O157菌进行检测,除犬钩端螺旋体以外均为阴性,表明钩端螺旋体PCR检测方法与以上菌株无交叉反应,证明了该钩端螺旋体PCR检测方法具有特异性;双链DNA灵敏度检测结果显示PCR方法可以检测到的核酸浓度最低为3×10³拷贝。此结果证明该犬钩端螺旋体PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏度,可用于犬钩端螺旋体样品的检测。     

十二种食源性致病菌可见光基因芯片检测方法的建立

[目的]利用可见光基因芯片技术,针对12种常见食源性致病菌,建立快速、准确、高通量的诊断方法。[方法]设计靶细菌16S rDNA和23S rDNA的通用引物,反向引物5’端标记生物素;特异寡核苷酸探针设计在两对引物之间的可变区,5’端标记氨基基团。将探针点样于固相载体制备基因芯片,优化PCR反应体系后,PCR产物与芯片点制探针区域进行杂交,然后通过化学显色直接观察结果,并评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性等指标。收集临床样本28例,同时制备双盲模拟污染样本10例,对检测方法进一步评价。[结果]：本试验所建立的基因芯片方法可同时检测志贺菌、耶尔森氏菌、沙门菌、腊样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李氏菌、布鲁氏菌、变形杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7等12种食源性致病菌,特异性高,操作简便;针对纯培养食源性致病菌反应体系的灵敏度为10^3cfu/mL,模拟样本的灵敏度为10^4cfu/mL;重复性好;采用可见光基因芯片方法检测28例临床样本,26例与常规培养方法结果完全一致,符合率达到92.9%;双盲模拟样本的检测符合率达到100%。     

转Bt基因作物恒温扩增快速检测技术

[目的]建立一种快速检测转Bt基因作物的方法。[方法]利用Bt的Cry1ab/ac基因序列设计特异性引物,建立LAMP检测方法以及优化反应体系,并进行LAMP的特异性和灵敏度试验。[结果]成功建立转Bt基因作物的LAMP检测方法,得到最优的反应体系。在特异性试验中,转Bt基因作物基因组DNA均呈阳性,而非转基因作物、转Bar基因作物、转CPTI基因作物、转EPSPS基因作物等均为阴性;在灵敏度试验中,转Bt基因作物的最低检测限为10个拷贝。[结论]LAMP方法具有很高的特异性和灵敏度,可用于转Bt基因作物的现场快速检测。     

MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统在台湾进口鳖蛋检疫中的初步应用

[目的]应用MALDI-TOF-MS和Biotyper分析软件对台湾进口的鳖蛋进行携带病原菌的检测。[方法]按照病原菌检测标准进行培养,选取可疑菌株,肉汤培养后,按照MALDI-TOF-MS要求进行样品制备、点靶以及样品质谱图的获取,并运用Biotyper分析软件对所获取的质谱图进行分析。[结论]应用MALDI-TOF-MS方法从进口鳖蛋中分离出绿脓杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌等致病菌,为进出口商、检验机构及其他相关部门敲响警钟。此鉴定方法简单快速,能够加快鳖蛋的通关速度,为两岸建设作贡献。     

酶联免疫分析法测定猪肠衣中磺胺二甲基嘧啶残留量

建立测定猪肠衣中磺胺二甲基嘧啶残留量的ELISA分析法。方法检测低限为5μg/kg;在5μg/kg、20μg/kg和100μg/kg三个添加水平进行加标回收试验,回收率分别为82.0%-96.0%、87.5%-102.0%和83.9%-105%;重复性试验：CV%分别为5.3%、5.3%和8.2%;重现性试验：CV%分别为8.0%、7.9%和7.5%。本方法灵敏度、准确度和精密度均符合残留分析质量控制的要求,适用于猪肠衣中磺胺二甲基嘧啶残留量的快速检测。     

医用手套表面残余矿物粉末快速鉴别技术研究

[目的]建立了一种采用XRD粉末衍射快速鉴别医用手套表面残余矿物粉末的方法。[方法]乳胶手套表面残余粉末通过水洗、过滤收集后,采用XRD方法测定了三种不同生产厂家的医用手套表面残余粉末。[结果]三种医用有粉手套的表面残余粉末均为矿物混合物粉末,含有滑石、白云石、菱镁矿、绿泥石、石英和方解石等几种矿物质,从XRD谱图中很容易辨别出矿物粉末和玉米淀粉。[结论]XRD是一种快速、准确的鉴别一次性医用有粉手套表面残余矿物粉末的方法。     

3种ELISA试剂盒对牛新孢子虫血清抗体比较检测

用瑞典Svanova公司、美国IDEXX公司和美国VMRD公司生产的3种检测新孢子虫血清抗体ELISA试剂盒对来自澳大利亚牛血清（41份）、新西兰牛血清（40份）、乌拉圭牛血清（30份）和中国新疆牛血清（46份）进行了同步检测和比较分析,并以其中2个试剂盒检测结果均为阳性或阴性的血清为真阳性或真阴性,对另1个试剂盒在诊断相对敏感性和相对特异性方面进行了比较评估。结果表明,3个试剂盒的诊断相对敏感性和诊断相对特异性分别为：85.7%和92.5%（Svanova）、95.8%和98%（IDEXX）、88.5%和98%（VMRD）。3个试剂盒都具有较好的重复性,检测低限相近。在对样品的检测中,IDEXX与VMRD两个试剂盒检测符合率较高,但对不同国家的样品检测符合率差别较大。     

石墨炉原子吸收分光光度法测定水样中铬的不确定度

[目的]通过对影响测定结果的不确定度因素的分析和量化,评价石墨炉原子吸收光谱法测定水样中铬的不确定度。[方法]调节仪器最佳测定条件,测定铬标准工作溶液系列并依据工作软件自动建立工作曲线和数学模型;连续测量10次水样,根据标准曲线获得未知样品铬浓度;分析石墨炉原子吸收分光光度法测定水样中铬的误差性质和来源,确定不确定度的主要因素,计算水样中铬的测量不确定度。[结果]扩展不确定度U95=0.016mg/L（Veff=20）。[结论]根据分析仪器的测定数据输出方式建立数学模型,进行不确定度评定,方法直观简明,与实际工作相符合。