抗草甘膦转基因大豆DNA标准分子构建及多重荧光PCR检测体系的建立

[目的]将抗草甘膦转基因大豆中的CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS 3种外源基因融合在PMD-18T载体并建立三重实时荧光PCR检测方法,实现通过一次PCR反应就能完成抗草甘膦转基因大豆的转基因成分检测。[方法]通过PCR扩增和基因克隆的方法构建含有CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS外源基因的质粒,设计TaqMan探针建立三重荧光PCR检测体系。[结果]成功构建融合抗草甘膦转基因大豆3种外源基因质粒PMD18T/SOY,并建立三重荧光PCR检测体系,检测限值为10-3 ng/μL,线性关系良好r,2在0.998以上。[结论]构建同时含有多种外源基因的质粒作为转基因检测的阳性参照物并建立多重PCR检测体系,不仅可降低试剂成本、节省时间和人力,而且可以减少PCR反应次数和加样环节,降低PCR污染的几率。     

转基因产品检测方法建立的基础及应用

随着转基因技术的发展,转基因生物及其产品日益增多.但其安全性问题引起人们的争论,各检验检疫口岸相继开展了转基因产品的检测工作.目前采用和待开发的转基因成分检测方法是建立在已商品化生产的转基因植物外源基因的构建及表达情况的基础上的,包括蛋白质检测和DNA检测.蛋白质检测方法有ELISA、试纸条检测和Western杂交,DNA检测方法有PCR、Southern杂交、基因芯片等,本文将分别详细阐述.     

数字PCR及荧光定量PCR测定豆乳饮料转基因成分分析

研究将转基因启动子CaMV35s、终止子NOS基因作为靶标,内标选择大豆内源基因Lectin,分别采用微滴式数字PCR及实时荧光PCR对标准品转基因大豆进行检测,实测20批次豆乳饮料转基因成份。结果显示,与实时荧光PCR相比,微滴式数字PCR对转基因筛查浓度检测低限、含量低限均较低,分别为0.04 ng/反应、0.05%,与欧盟转基因标识阈值要求符合。20批次样品中有16批次经过不同平台检测结果为阴性,1批次为阳性,3批次经过数字PCR检测获得准确结果,表明该检测技术能对实时荧光PCR起到辅助检测作用。     

多重PCR检测食品中转基因成分研究

[目的]建立检测转基因食品的多重PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测体系.[方法]针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件,包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因,同时选定植物本身固有的大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因,设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR,结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系,对转基因食品进行检测,1～2天能完成整个检测过程.对珠海地区市售的大豆、玉米、油菜及其加工产品共185个样品中的转基因成分进行了初步调查.[结果]建立的多重PCR检测体系稳定可靠、特异性好,灵敏度高.调查的185份可疑食品样品中,转基因阳性率达27.6%.[结论]该检测体系快速可靠、灵敏准确、特异性好,且操作简便、成本低廉,是一种进行转基因食品检测的良好的技术模式.对珠海地区的转基因食品状况有了一定了解.     

抗病毒转基因番木瓜的实时PCR检测

番木瓜是世界上第一种大规模种植的转基因水果,多个国家和地区开展了转基因番木瓜的研究和田间试验。针对市场上可能遇到的转基因番木瓜种类,本文分析了这些转基因木瓜的外源基因结构,在外源基因的NOS启动子与植物基因组之间的侧翼序列中设计了3类转基因木瓜的4个品系（Event）的特异性实时PCR的引物/探针,建立了4种抗病毒转基因番木瓜的品系特异性实时PCR检测方法,优化了番木瓜果肉和种籽的DNA纯化方法。实验表明这些品系检测方法的特异性和灵敏度符合出入境检验检疫的要求,应用这些方法从市售的番木瓜中检出了台湾中兴大学研发的两个转基因品系。     

Roundup Ready大豆中Lectin、CaMV 35S、NOS和CP4 EPSPS基因的提取与RT-PCR定性范围研究

[目的]研究Roundup Ready大豆的Lectin、CaMV35S、NOS和CP4EPSPS等被检测基因的RT-PCR定性范围。[方法]用CTAB法提取DNA,对Lectin、CaMV35S、NOS和CP4EPSPS等被检测基因的检测条件进行了优化,确定了被检测基因在相同RT-PCR条件下的定性范围。[结果]研究发现,不同被检测基因在相同RT-PCR条件下的浓度检出范围不同。Lectin为0.05～792mg/L,CaMV35S为0.25～792mg/L,NOS为0.25～396mg/L,CP4EPSPS为0.05～1980mg/L;共同的方法检出限LOD为5ng,体系浓度范围为0.25～396mg/L。[结论]确定了Roundup Ready大豆被检测基因的定性范围和检出限,可应用于大豆中相关基因的检测。     

植物油DNA提取和基因检测的研究进展

为了对植物油的质量安全提供更好的保障,人们以分子生物学理论为基础,建立了有效的分析方法,发挥高灵敏度、操作简便、快速准确等优势,在植物油转基因成分、掺假检测中广泛应用。但是,植物油一般都进行了加工精制,DNA含量较少,完整度较低,因而在提取检测植物油基因的过程中难度较大。为此,对高质量DNA有效提取,是植物油基因检测的重点内容。基于此,对植物油DNA提取和基因检测开展了研究。     

转基因农作物是怎样检测的?

近年来,转基因生物技术发展迅速,以大豆、玉米、菜籽等为代表的各种转基因农作物(GMO)已经商品化.目前,世界各国对由转基因农作物而引发的各种食品安全性的争论和管理对策已日渐明确.参照世界上各国已出台或规划中的标准方法,加快我国有关转基因食品测试标准的制定和实施细则的出台,已是我国农业和食品与卫生业界的当务之急.下面仅就各国对有关GMO检测方法的开发状况以及各国采用的官方的GMO检测方法、检测原理、检测仪器、检测图象、检测报告以及现存的一些问题作一简要论述.     

应用多重PCR同时检测多种转基因成分

以多重PCR方法在反应体系中加入1对到3对引物同时检测转基因矮牵牛与阳性对照质粒中的1～3个外源基因,包括花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NptⅡ)编码基因.结果表明多重PCR方法不但可以提高检测效率、降低检测成本,还可以有效防止假阳性.是一种值得推广的方法.     

第二次绿色浪潮的动力——基因食品

基因食品引发了第二次绿色革命80年代初期,人们在研究一种叫农杆菌的病原细菌侵染机制时,发现了有部分细菌 DNA 可以转移到植物染色体中,并可稳定遗传给后代。1994年5月,美国食品和药品管理局批准了第一例转基因作物的商品化生产,这种转基因番茄的商品名称是 FLAVR-SAVR,可延迟番茄成熟时间,有利于其运输与加工。此后,抗除草剂的大豆和抗玉米螟的玉米也相继上市,现在已经商品化的转基因作物有20多种,包括玉米、大豆、油菜、马铃薯、番茄、棉花和烟草等主要粮食和经济作物,仍待批准的还有10多种。到1998年,转基因作物在全世界种植就达到3000万公顷以上,约占全球作物栽培面积的2～3%,种植面积最多的国家目前依次是美国、中国、阿根廷、巴西和澳大利亚等国家。美国去年转基因玉米、大豆和棉花     

十二种食源性致病菌可见光基因芯片检测方法的建立

[目的]利用可见光基因芯片技术,针对12种常见食源性致病菌,建立快速、准确、高通量的诊断方法。[方法]设计靶细菌16S rDNA和23S rDNA的通用引物,反向引物5’端标记生物素;特异寡核苷酸探针设计在两对引物之间的可变区,5’端标记氨基基团。将探针点样于固相载体制备基因芯片,优化PCR反应体系后,PCR产物与芯片点制探针区域进行杂交,然后通过化学显色直接观察结果,并评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性等指标。收集临床样本28例,同时制备双盲模拟污染样本10例,对检测方法进一步评价。[结果]：本试验所建立的基因芯片方法可同时检测志贺菌、耶尔森氏菌、沙门菌、腊样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李氏菌、布鲁氏菌、变形杆菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7等12种食源性致病菌,特异性高,操作简便;针对纯培养食源性致病菌反应体系的灵敏度为10^3cfu/mL,模拟样本的灵敏度为10^4cfu/mL;重复性好;采用可见光基因芯片方法检测28例临床样本,26例与常规培养方法结果完全一致,符合率达到92.9%;双盲模拟样本的检测符合率达到100%。     

饲粮中高铜高锌在组织中残留及排泄规律的研究

研究了在20～100kg生长猪饲粮中添加不同水平的铜和锌对猪组织中铜和锌残留量及排泄规律的影响。54头（长白×约克二元杂交）猪随机分成6个组,各组在基础日粮中添加铜和锌（硫酸铜/硫酸锌,mg/kg）水平为：0/0、170/130、250/430、300/630、350/830、400/1030,试验期为90d。结果表明,与对照组比较,使用高铜高锌饲粮会显著增加肝中铜和锌的残留量（P〈0.05）,铜的残留量随用量的增加呈线性上升,锌的残留量在添加（铜/锌）量250/430mg/kg时,最高;肉中铜和锌在添加量（铜/锌）分别达到350/830mg/kg、300/630mg/kg时,达到最高（P〈0.05）;粪中排出的铜和锌量与饲粮中添加量有密切关系,添加量越多,排泄量越多,呈线性上升。使用高铜高锌饲粮会增加肝脏、肌肉中铜和锌的残留量,增加粪中的排泄量。     

超高效液相色谱-串联质谱测定苹果制品中的棒曲霉素

建立了简单、快速测定苹果制品中棒曲霉素的超高效液相色谱-串联质谱确证检测方法。样品经乙腈提取,并经Mycrosep 228AflaPat多功能柱净化后,采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测。标准溶液在2100μg/L范围内呈线性相关（r：0.999）,不同基质样品中添加回收率为83%98%,RSD〈10%。该方法操作方便、快速,灵密度高,可满足苹果制品中棒曲霉素测定的要求。     

旋毛虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用研究

根据旋毛虫隔离种线粒体Ls-rRNA基因序列,设计一对特异性引物及TaqMan MGB探针。以Ls-rRNA阳性重组质粒为模板,建立了旋毛虫实时荧光PCR检测方法。该检测方法对各旋毛虫隔离种具有良好的特异性,而对小鼠、狗和猪正常肌肉组织、猪鞭虫、猪蛔虫、猪钩虫、犬蛔虫等无交叉反应。最小检出量为1.32×10^2拷贝（10^-5条旋毛虫）,建立的标准曲线拟合良好,扩增方程Y=-3.43X＋19.70,相关系数R^2=0.9984,扩增效率为95%。平行检测组内变异系数为1.11%（n=20）,同一组不同浓度梯度样本（n=9）间隔30d重复检测,结果无显著性差异。人工感染不同剂量猪旋毛虫的小鼠,在攻虫14d后检出率100%。对经压片镜检、人工胃液消化、胶体金试纸条检测结果为阴性的63份送检狗肉样本中敏感地检出8个阳性。     

LAL／GNB法筛选辐照鸡肉的应用研究

【目的】探讨内毒素检测（LAL）与革兰氏阴性菌计数（GNB）相结合的方法应用于辐照鸡肉的筛选的可能性。【方法】市售鸡肉丁以50g每份分装后,以γ射线进行辐照处理,剂量分别为0kGy、2kGy、6kGy,每个剂量各12份,通过革兰氏阴性菌的培养计数估计样品中存在的活的革兰氏阴性菌的量,通过内毒素浓度定量估计活的和死亡的革兰氏阴性菌总量,比较两者差异来判定是否经过辐照处理。[结果】辐照剂量为6kGy时,12个样品被检测出经过辐照处理。辐照剂量为2kGy时,8个样品被检测出经过辐照处理,4个样品检测出未经过辐照处理。辐照剂量为0kGy时,12个样品检测结果均为未经过辐照处理。【结论】LAL／GNB法可以应用干辐照鸡肉的筛选。     

Milk yields,physico‐chemical properties and composition of milk from indigenous Malawi goats and their Saanen half‐breds

A study to compare milk yield, some physico‐chemical properties and the chemical composition of milk from 23 indigenous Malawi goats and 10 Malawi local × Saanen crosses was carried out from January to March 2000. The results showed that the average milk yield from the crosses (102.0 ± 11.21 kg) was higher (P < 0.01) than that from the indigenous goats (37.1 ± 4.79 kg). However, the pH and specific gravity of both milk samples did not differ significantly from each other. The latter was attributed to the fat and total solids contents, which did not differ significantly in the two milk samples. Although the crude protein content was not significantly different, lactose and minerals, namely calcium, sodium, magnesium, potassium and chloride, were higher (P < 0.01) in milk from the crosses than in milk from the indigenous goat. The results have shown that the levels of nutrients in goat milk are high, and this is indicative of its potential to improve the diets of rural Malawians. Also, as smallholder farmers sell raw unheated milk to the processing plants, such milk should not be kept for> 33 h in the cool dry season and for not> 20 h in the hot dry season. Farmers can also adopt a charcoal cooler to save the milk for an even longer time than they can at room temperature. In this case, the raw milk can only be stored for not> 20 h in the cool dry season and not> 16 h in the hot dry season.     

蜂蜜中蛋白质及氨基酸含量的测定

分别采用考马斯亮蓝法和茚三酮显色法测定6个蜂蜜样品中的蛋白质和氨基酸含量。实验结果表明,100 g蜂蜜样品中,蛋白质和氨基酸的含量分别为0.044~0.391 g和0.031~0.055 g,表明不同蜂蜜样品中的蛋白质和氨基酸的含量各不相同。蜂蜜样品中蛋白质和氨基酸测定时的相对标准偏差分别为0.666%~6.447%和0.601%~1.306%,平行样品间的测定误差较小。     

UPLC／MS／MS测定动物组织中4种氟喹诺酮类药物残留量

本文建立了动物组织中4种氟喹诺酮类药物（恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星）同时检测的超高效液相色谱串联质谱法。采用乙腈提取样品中的药物,然后加入乙腈饱和正己烷脱脂、除杂,提取液浓缩、定容后进超高效液质联用仪（UPLC／MS／MS）检测,外标法定量。方法的回收率为75％-100％,相对标准偏差〈10％．定量限为1μg／kg。     

基因芯片在犬病病原体检测中的应用

为了实现犬病的快速诊断,本研究利用高通量的基因芯片技术,建立了犬传染性肝炎、犬瘟热和犬细小病毒病基因芯片快速检测方法,同时提取DNA和RNA病毒核酸,再用多重不对称PCR扩增目的片段,与芯片上探针特异结合,实现了3种犬病同时检测,CDV、CAV的检测灵敏度达10^2copies,CPV的检测灵敏度达10^3copies。